青黴素結合蛋白

青黴素結合蛋白(PBPs)是位於細菌細胞膜上的一些膜蛋白,最初發現時因為能和青黴素共價結合而得名。1972年Suginaka等第一次報導了青黴素結合蛋白(PBPs),他們用放射性同位素標記的青黴素標出了細菌表面的PBPs。後來研究發現PBPs也能與非β-內醯胺類抗生素結合。另外非細菌如螺旋體也可能有PBPs。PBPs是參與細菌細胞壁肽聚糖生物合成的酶,包括轉肽酶、羧肽酶、內肽酶。它的正常存在是細菌保持正常形態及功能的必需條件,青黴素等抗生素正是通過與PBPs結合抑制細菌細胞壁的生物合成引起細菌細胞死亡從而發揮殺菌作用。一旦青黴素結合蛋白的數量、種類或者與抗生素的親和力發生變化將會影響細菌的形態或者對抗生素的敏感性。細菌青黴素結合蛋白改變引起的細菌對抗生素的耐藥性目前仍是研究的熱點之一,其研究對於抗生素的改造、新抗生素的設計均有指導意義。

基本介紹

• 中文名：青黴素結合蛋白
• 外文名：Penicillin binding proteins（PBPs）

分類

按照細菌對各種β-內醯胺類抗生素的敏感度，可以將PBPs大致分為兩類:①對青黴素敏感度稍差，但對大多數頭孢菌素敏感的PBPs:分子質量較低(Mr24.8～34.7ku)，一般是D，D-肽酶，作用於肽或羧肽羧基供體相似物。如金黃色葡萄球菌的PBP4，大腸埃希氏菌的PBP5、PBP6;②一般對青黴素和頭孢菌素均敏感的PBPs:分子量較高(Mr59.5～89.3ku)，其羧基末端是青黴素結合域催化青黴素敏感的肽聚糖轉肽酶反應(肽交聯)，氨基末端催化青黴素不敏感的肽聚糖轉糖基酶反應(糖鏈延伸)，如大腸埃希氏菌的PBP2、PBP3。已知不同的抗生素作用於不同的PBPs上，即使是同一抗生素作用於不同細菌也是作用於不同的PBPs上。如頭孢噻肟作用於鏈球菌的靶位是PBP2X，而作用於金黃色葡萄球菌的靶位是PBP2，苯唑西林也主要作用於金黃色葡萄球菌的PBP2，同時金黃色葡萄球菌的PBP3卻是頭孢拉定的主要作用點。作用於同一PBPs靶位點的抗生素合用會產生相互拮抗作用，作用於不同PBPs的β-內醯胺類抗生素在聯用時可產生協同作用。

結構

以前是通過細菌提取的羧肽酶的青黴素-肽衍生物的胺基酸序列分析弄清了數種PBPs的活性中心，結果顯示細菌PBP活性中心常是絲氨酸，β-內醯胺類抗生素正是通過其β-內醯胺環中的羧基和細菌相應的PBPs的絲氨酸的羥基共價結合成絲氨酸酯起作用。另外也有研究表明可能存在半胱氨酸-巰基為活性中心的羧肽酶。後來又有人聯合液相色譜法和納電噴霧法來鑑定PBP活性中心絲氨酸，在體外作β內醯胺類抗生素和重組PBP的共價結合，乙醯化的肽被分離以及用胰島素作進一步的消化。消化後的肽納-電噴霧法測序顯示青黴素是和PBP2a403位絲氨酸結合在一起的。研究表明低分子質量的PBPs和A類β-內醯胺酶有相似的二級結構空間排布，均是雙結構域的蛋白，一個是全α-型結構，另一個是核心由5個β-片層外加兩面都有的α-螺旋組成的結構。它們還有相似的三級結構，並且在三級結構中相同的關鍵位置至少有三個盒，包括Ser-Xaa-Xaa-Lys盒，位於一級結構-60～80處產生於全α-型結構的一個螺旋的胺基酸末端，這樣一來繞過一個螺旋之後賴氨酸殘基側鏈又重新回到活性中心區域;Lys-Thr-Gly/His-Thr-Gly盒，位於羧基末端的上游-60～70處產生於5個β-片層最裡面的一個，組氨酸咪唑環或賴氨酸ε-胺基酸也指向活性中心，因此組成了活性中心的另一邊;最後一個，大概位於一級結構的中部(更接近羧基末端)，有帶陰性電荷的殘基，Asp225/Glu150/Glu166，產生於連線兩個螺旋的環上，構成活性中心的入口。也有研究認為PBPs青黴素結合區包括此3個保守序列:含胺基酸活化位點的SerXxxXxxLys(SXXK盒)、SerXxxAsn(SXN盒)、LysThr/SerGly(KT/SG盒)。現在人們用分子動力學模擬，量子力學及X-射線衍射等方法進一步研究了PBPs的晶體結構，活性位點的胺基酸序列及抗生素與PBPs具體醯化步驟。目前已搞清楚MRSA的PBP2a晶體結構是由三部分組成:①N-末端跨膜區;②糖基轉移酶區;③轉肽酶區，含β-內醯胺類抗生素作用位點。如果這些保守序列或相鄰的胺基酸被替代，β內醯胺類抗生素不能有效地與PBPs結合而導致耐藥。

功能

不同細菌的PBPs組成不同，其功能也各不相同，研究表明並非所有的PBPs均是抗生素的作用靶位。按其與細菌生理功能的關係及抗生素作用後的反應大致可以將它們分為細菌生長必需蛋白和生長非必需蛋白。現在研究得比較多的是革蘭氏陽性菌中的肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等，革蘭氏陰性菌中的大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈瑟氏菌、流感嗜血菌等。

以大腸埃希氏菌為例闡明不同的PBPs的功能。大腸埃希氏菌含有7種PBPs，依次為PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5、PBP6。PBP1a為細菌生長非必需蛋白，缺乏PBP1a的變異株能夠存活。PBP1b是維持細菌生長的重要蛋白質，是肽聚糖交聯過程中的必需酶，也是青黴素溶解細胞作用的靶位。PBP2能維持大腸埃希氏菌的張力，使菌體保持桿棒狀，當基因突變引起PBP2減少或缺乏時可使細菌變成圓球形而致溶解死亡。PBP3與細菌分裂有關，是隔膜的胞壁質形成的必須成分，抗生素選擇性的作用於PBP3後，能夠阻止大腸埃希氏菌的分裂並使細胞形成絲狀體而不溶解。PBP4同時具有D，D-羧肽酶活性及D，D-內肽酶活性，但不是β-內醯胺類抗生素的主要作用靶位。PBP5是細菌生長非必需蛋白，具有D-丙氨酸羧肽酶IA的活性，而這個酶在細菌體內能保護大腸埃希氏菌不致被低濃度的β-內醯胺類抗生素殺死。PBP6具有D-丙氨酸羧肽酶I的活性，在細菌的靜止期的含量遠比指數生長期的要高(2～10倍)，能在靜止期穩定肽聚糖的結構。有研究者發現另有兩種青黴素結合蛋白PBP7(31.8ku)和它的蛋白降解產物PBP8(28.8ku)，均有D，D-內肽酶活性，特異性地水解大分子的細胞壁質的D，D-DAP-Ala間的肽鍵。克雷伯氏菌、沙門氏菌和銅綠假單胞菌的PBPs類型和大腸埃希氏菌高度相似。有報導PBPs還參與AmpC酶誘導產生過程，該酶是細菌的某種低分子質量PBP(PBP4或PBP7)暴露於β-內醯胺類抗生素後分泌的，這種低分子質量的PBPs很可能是β內醯胺酶的前體。

與產β-內醯胺酶細菌的關係

PBPs與革蘭陽性菌

革蘭陽性細菌細胞壁可自由透過β-內醯胺類抗菌藥物，除產生β-內醯胺酶菌株外，革蘭陽性菌一般對青黴素敏感，PBPs介導的耐藥在臨床上最常見的是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。然而據報導，發現在腸球菌中已經出現了耐萬古黴素菌株，這種耐藥性可在實驗中轉移到金黃色葡萄球菌中去。在正常情況下，金黃色葡萄球菌有5種PBP，為其固有蛋白質，其分子量分別為87ku(PBP1)，80ku(PBP2)、75ku(PBP3)、70ku(PBP3)和41ku(PBP4)，其中PBP1、PBP2、PBP3是細菌所必需的且與β-內醯胺類抗菌藥物具有高度的親和性。而耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中的PBP2a，分子量為78ku為耐藥菌株所特有的，不是菌體必需的蛋白質，但有了它細菌就可以對青黴素產生耐藥。PBP2a可由β-內醯胺類抗菌藥物誘導產生並且與β-內醯胺類抗菌藥物親和力很低，所以很少被該類抗菌藥物結合。PBP2a具有其他高親和力PBPs的功能，當高親和力的PBPs被β-內醯胺類抗菌藥物結合而失去功能時，PBP2a的存在仍能維持細菌生長與存活，使其成為耐藥菌株，因而PBP2a是MRSA對β-內醯胺類抗菌藥物耐藥的主要機制。有證據表明，不同的β-內醯胺類抗菌藥物對PBP2a的誘導有差別，並非結構基因(mecA)的突變。臨床分離的中度耐頭孢氨苄和頭孢拉定的金黃色葡萄球菌，發現其耐藥性與PBP3親和力降低有關，將PBPs基因通過轉化方式可使敏感菌產生耐藥性。青黴素結合蛋白在革蘭陽性菌細胞壁合成過程中起著關鍵的作用。因其種類繁多，編碼基因不同，分子質量大小也有很大的差異，但其作為肽聚糖合成中的關鍵酶類的功能相近。葡萄球菌耐藥菌株中新出現的低親和力的PBPs阻止了β-內醯胺類抗菌藥物對細菌的抑制作用，當其他高親和力的PBPs由於抗菌藥物結合而失去活性時，這些低親和力的PBP，補償其他PBP，從高抗菌藥物親和力向低親和力方向改變，從而出現耐藥性。在發生β-內醯胺類抗菌藥物耐藥時，PBPs相應的基因發生變異，構成了細菌耐藥機制中的重要部分，因此進一步深入研究革蘭陽性菌的PBPs及其相關耐藥機制，將對臨床用藥及新藥開發提供重要參考。

PBPs與革蘭陰性菌

革蘭陰性菌因其外膜蛋白較薄，因而膜的穿透能力變化較大。而膜孔蛋白通道非常狹窄，能對大分子及疏水性化合物的穿透形成有效屏障，外膜屏障使細菌對抗菌藥物產生不同程度的固有耐藥性，且多數革蘭陰性細菌產生β-內醯胺酶。導致革蘭陰性菌β-內醯胺類藥物耐藥的機制主要是青黴素結合蛋白各種亞單位編碼基因突變導致PBPs構象改變，β-內醯胺類抗菌藥物與構象改變的PBPs結合力下降而耐藥。外膜屏障與β-內醯胺酶具有明顯的協同作用，即通透性降低的作用可使有效的酶滅活系統加強。外膜通透性降低導致細菌產生耐藥性主要由於出現膜孔蛋白缺陷株、多向性突變、特異性通道的突變或脂質雙層改變等。近年來，外膜通透性降低而出現的耐藥性已越來越多，如綠膿桿菌等引起的嚴重感染主要是因為抗菌藥物對細菌外膜蛋白顯示低通透性所致。對於PBPs必需含量發生變化或缺失、與抗菌藥物的親和力降低、細菌產生緩慢結合的PBPs、誘導性PBPs的出現，即不依賴β-內醯胺酶的存在而對β-內醯胺類抗菌藥物耐藥，這種由PBPs介導的耐藥性在革蘭氏陽性菌中比革蘭氏陰性菌中更常見。因此，革蘭陰性細菌對β-內醯胺類抗菌藥物的耐藥性與PBPs改變的關係不如革蘭陽性細菌明顯和重要。