電鏡三維重構技術

電鏡三維重構技術是電子顯微術、電子衍射與計算機圖像處理相結合而形成的適於分析難以形成三維晶體的膜蛋白等大的複合體三維結構的分析技術。

基本介紹

• 中文名：電鏡三維重構技術
• 概述 ：電鏡三維重構技術是電子
• 原理：D.DeRosier和A.Klug提出的三
• 相關套用：冷凍電鏡單粒子法  三維冷

概述

電鏡三維重構技術是電子顯微術、電子衍射與計算機圖像處理相結合而形成的具有重要套用前景的一門新技術，尤其適於分析難以形成三維晶體的膜蛋白以及病毒和蛋白質-核酸複合物等大的複合體的三維結構。其基本步驟是對生物樣品在電鏡中的不同傾角下進行拍照，得到一系列電鏡圖片後再經傅立葉變換等處理，從而展現出生物大分子及其複合物三維結構的電子密度圖。

近年來,電鏡技術迅速發展,特別是電鏡在生物學中的套用,目前已不僅停留在單純直觀的描述,而且已開展了由定性到定量,由平面到空間的立體研究。這對深人了解生物材料尤其是細胞成分的空間相對位置和生物大分子的空間結構及其與功能關係,都有十分重大的意義。與此同時,電鏡技術正在逐漸與數學和物理學的有關領域結合起來,從而給生物科學工作者提供了很多定量的信息。其中,用傅立葉變換法(以下簡稱傅氏變換法)進行生物大分子三維重構的電鏡技術就是一個相當突出的例子。用普通透射式電鏡在正常的工作電壓(50一80千伏)下,樣品厚度不宜超過0.1微米。因此,在觀察組織、器官、大細胞時,需先製成超薄切片。在觀察蛋白質分子、病毒時,不需切片,但在製片的乾燥過程中,顆粒的細節也會彼此疊加,因此用電鏡觀察得到的結果實際上是一種平面的二維信息,它不能反映出物體結構中原有的內在的空間關係。如希望得到立體結構的信息,就要進行三維重構,即從二維信息中推導出三維信息。

二十世紀七十年代TaylorK和GlaeserRM開創了冷凍電子顯微術（cryo-electronmicroscopy,Cryo-ME）[1]，經過近三十年的發展，冷凍電鏡技術已經成為研究生物大分子結構與功能的強有力的手段。最近幾年冷凍電鏡的發展在研究大分子結構上的解析度已達到10-15Å。雖然不及X射線晶體學,但它具有許多獨特的優勢：可以對均一的（如膜蛋白的二維晶體，二十面體對稱的病毒等對稱結構）不均一的（如核糖體等）樣品用不同的方法進行三維結構重構，可以對生物大分子及其複合物或亞細胞結構進行測定，使小到蛋白質大到真核細胞的三維結構得以確定，分子量大小跨越了12個數量級。通過快速冷凍可以將樣品保存在生活狀態，其結構更接近功能活性狀態；由於快速冷凍可以捕捉到反應過程的瞬時狀態從而易於進行時間分辨層面上的研究，從而對一些反應瞬時過程，和反應中間體進行研究，有助於對蛋白質的動力學特性和功能的研究。

三維冷凍電鏡技術將更完善的樣品製備方法，先進的儀器設備，更好的成像方法和強有力的數據處理和運算方法結合起來，使結構測定的解析度不斷得到提高。樣品製備主要採用快速冷凍的方法，以保持其天然活性；儀器設備則可採用場發射電鏡和CCD（charge-coupleddetector,電耦合探測器）攝像系統；確定結構的方法主要有電子晶體學、單粒子法和電子斷層成像技術，對於數據處理則主要藉助各種軟體和傅立葉變換的算法進行二點陣圖像的三維重構以獲得實物空間的三維結構。本文將在這幾個方面介紹冷凍電鏡三維重構技術及進展。

原理 電鏡三維重構的思想早在1968年就由D.DeRosier和A.Klug[2]提出，而冷凍電鏡技術則是在1974年首次由TaylorK,和GlaeserRM創建。三維冷凍電鏡技術主要是將樣品保存在液氮或液氦溫度下利用透射電子顯微鏡進行二維成像，再經過對二維投影圖像的分析進行三維重構。

原理

一、電鏡三維重構理論

D.DeRosier和A.Klug提出的三維重構理論是藉助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來重構被測物體的立體構型；他們提出利用計算機數字圖像處理技術進行電子顯微像三維重構測定生物大分子結構的概念和方法。電鏡三維重構思想的數學基礎是傅立葉變換的投影與中央截面定理。中央截面定理的含義是一個函式沿某方向投影函式的傅立葉變換等於此函式的傅立葉變換通過原點且垂直於此投影方向的截面函式。因此電鏡三維重構的理論基礎是一個物體的三維投影像的傅立葉變換等於該物體三維傅立葉變換中與該投影方向垂直的，通過原點的截面（中央截面）。每一幅電子顯微像是物體的二維投影像，傾斜試樣，沿不同投影方向拍攝一系列電子顯微像，經傅立葉變換會得到一系列不同取向的截面，當截面足夠多時，會得到傅立葉空間的三維信息，再經傅立葉反變換便能得到物體的三維結構。這種方法可以在很廣泛的範圍內套用，從無固定結構特徵的細胞器和生物大分子複合物到大分子晶體。在該理論的基礎上，R.Henderson和N.Unwin建立了蛋白質電子晶體學。從20世紀70年代至今，蛋白質電子晶體學技術已逐步發展為蛋白質結構解析的的一種實用方法。

二、三維冷凍電鏡技術

冷凍電鏡經過近三十年的發展,。冷凍電鏡技術已成為研究生物大分子結構與功能的強有力的武器。這種方法採用高壓快速液氮冷凍方法使樣品包埋在玻璃態的水環境中，這種環境接近於生理狀態，減少了樣品在製備過程中的結構破壞，使我們能夠觀察到生物大分子在天然狀態下的結構。同時冷凍的速度極快，這就有可能把細胞在其生理活動（例如，肌肉收縮）的某些特定時刻固定下來，並進而顯示此時的結構特點，進而可通過不同功能狀態的瞬時構像變化來研究生物分子的功能。冷凍電鏡獲得的是處於天然狀態下未經染色的分子的二維投影像。將樣品進行不同角度的傾斜所獲得的數據進行綜合分析，並依據樣品的不同特性使用不同的重構技術獲得分子的結構。。由於樣品未經染色，很容易受到電子束的損傷。將樣品快速冷凍（樣品處於玻璃態）並在低溫下觀察樣品，一定程度上可以減少電子束對樣品的損傷，因此稱為冷凍電鏡。為了使樣品能夠在整個成像過程中受到的輻射總劑量損傷最小，而又能產生可分辨的圖像，大約只有10-20e/Å2（液氦溫度下：4.3K）或5e/Å2（液氮溫度下：77K）可以用來成像，這樣低的輻射劑量會導致圖象信躁比（SNR）較低。因此要獲得大量的圖象來進行矯正和平均以增加SNR從而獲得結構信息。場發射槍的套用提高了原始數據的質量，新的計算機軟體的套用使遠距離顯微操做和記錄成為可能。電子晶體學，單粒子法，電子斷層成像技術分別針對較小的對稱結構，較大的不對襯結構和更大的亞細胞結構進行三維重構和功能研究。

相關套用

冷凍電鏡單粒子法 三維冷凍電子顯微術已經在確定結構組成和大分子複合物的結構層次方面取得了重要進展。單粒子冷凍電鏡技術是獲得三位重構圖像的重要的方法。單粒子法就是對分離純化的顆粒狀分子進行結構分析。既可以對有二十面對稱結構的病毒或螺旋對稱結構進行分析，也可以對象核糖體等大的可溶性複合物進行結構分析，還可以對溶解狀態的膜蛋白進行分析。其基本原理是通過對相同的生物大分子某方向的投影顯微像在時空中經調整後進行疊加，從而提高信噪比，最後將不同投影方向的單顆粒顯微像在三維空間進行重構獲得單顆粒大分子的三維結構信息。主要步驟可分為以下幾點：1、製備化學和結構上均一的生物大分子的冰凍含水樣品，2、選擇最有可能能夠產生最佳圖像的最佳的顆粒密度和玻璃態冰厚度的樣品，3、設定最佳的參數（比如：欠焦值、放大倍數和電子劑量等）記錄這些樣品區域的大量圖像，4、用手工或半自動程式選擇那些離散的分子形成的投影圖，5、通過計算不同圖像之間的相對方位來重組出複合物的三維結構模型。6、最後可以利用從晶體學或NMR獲得的結構將原子坐標定位到密度圖中。為了使結構的解析度接近10Å或更高，也可以對在分離的和複合的大分子環境細微的結構差異進行校正[4]不用結晶是該方法的最大優點，而且對於研究傳統方法不易研究的大分子複合物像核糖體有很大優勢。

冷凍電鏡單粒子法

由於低劑量的電子輻射使得圖像的信躁比(SNR)非常低，要提高信躁比，就必須採集更多的圖像數據，通常要求>10000張，才能滿足分子解析度的要求，而要獲得原子分辨水平（~4Å）的結構需要上百萬張圖像[5，6]，若要人工處理這些數據將是一項耗時乏味的體力活，也因此成為冷凍電鏡獲得高分辨圖像的一個瓶頸，因此需要發展自動化採集單離子圖像的方法，該方法發展將成為冷凍電鏡領域裡一項重要課題。Nicholson,W.V.等人在2001年的綜述中把幾種不同的單粒子選擇方法歸納為五類[7]:1、Template-based方法;2、edgedetection-based方法;3、Intensitycomparision方法;4、Texture-based方法;5、Neuralnetwork方法。近來大量研究小組在該領域裡取得了重要的進展，出現了一些改進的方法，比如learned-based方法[8],TYSONlocalvariance方法[9],兩步法等[10]。JournalofStructuralBiology145(2004)這一期集中介紹了在單粒子法中圖像自動採集方法的研究進展。儘管運用冷凍電鏡單粒子法還無法獲得足夠高解析度的三維結構以建立條帶結構模型，但測定的結構中可達到的解析度已小於10Å。隨著計算機圖象處理技術的發展尤其是圖象自動採集技術的套用，數據收集會越來越快，解析度也會逐步提高。

想要將三維冷凍電鏡方法建立為測定三維結構的常規方法理論上，除了在顆粒圖像選擇方法上建立自動化技術外，還需要在各個步驟進行改進，實現自動化過程。包括樣品製備，數據收集，結構校正，以及將X-ray圖與電鏡密度圖重疊已獲得更全面的信息。其中一些已取得了一定的進展.圖像探測技術對解析度也有很大影響新一代的4K×4KCCD（charge-coupleddetector）照相機可以在120KV電壓下在10-15Å解析度水平上進行掃描拍攝圖像，並且可以在低放大倍數下從中央記錄圖像並確定玻璃化凍的厚度。

冷凍電鏡單粒子法使我們在分子水平對生命過程有了新的認識。核糖體是一個由多種結構相互作用形成的RNA蛋白質複合體，他的結構解析是對這種技術套用的最好說明。從70年代Frank開始對核糖體進行單顆粒分析以來,二十多年的努力使得大腸桿菌70S核糖體1.5nm解析度的三維結構已經得到揭示

從這個三維結構模型中我們可以清楚地分辨出各RNA、蛋白組分和它們之間的連線關係。雖然一系列核糖體的三維晶體結構已有報導,但單顆粒分析對於研究核糖體在蛋白合成過程中的結構變化仍是唯一有效的手段[12]。由於冷凍電鏡可以捕捉到生物分子在不同活性狀態下的瞬時構像，我們可以通過分子的構像改變來了解某個生命活動過程。轉錄的基本過程，mRNA剪接與移位便是成功的例子[13].核糖體合成蛋白質的整個循環過程中的不同中間狀態也已通過冷凍電鏡確定。通過這些不同狀態的密度圖，我們可以確定tRNA和延長因子結合的順序過程，同時也可描述核糖體亞基自身的構像變化。這些運動是mRNA轉位和新生肽鏈延長的基礎。

理解生物大分子和大的複合物的反應機制是當今生物學領域裡的一項重要目標。而完成這項任務的途徑便是通過鑑定關鍵反應的中間過程並把握其特徵。實間分辨（time-resolution）的冷凍電子顯微鏡便是一種方法，可使空間解析度達1nm左右，時間解析度達到數毫秒。冷凍電鏡是僅有的從總體上來講適合於在快速時間解析度上研究大分子及其複合物的構象變化的一種方法。快速冷凍以捕捉反應中間體的可能性許多年以前就已經清楚了，但是只有在引入了噴霧方法以快速混合樣品中的大的和小的分子並形成足夠薄的樣品以利於進行顯微成像之後才變為可行。第二代時間分辨冷凍電鏡儀器使用分檔器和電噴霧技術[14]，運用冷凍電鏡來研究生物大分子及其複合物的瞬時反應的構像。通過在幾毫秒到幾十秒的時間內將反應物快速冷凍以捕捉反應中間過程。將樣品點到電鏡銅網上並在液態乙烷中冷凍後使用計算機控制之後的顯微步驟。為了獲得最大的時間解析度，在冷凍前可向已覆蓋有一薄層反應物的銅網上噴灑含有另一種反應物的液滴。該過程是在電場作用下進行的電噴霧，每個載網需1-2μl的溶液進行噴霧，產生小於1μm的霧狀液滴。第二種方法是冷凍前先將兩種溶液用攪拌器混勻再點到載網上，這種方法用於反應時間大於1s的反應物。蛋白質反應的結構變化可以在10-15s內發生，但像結構域的變化幅度較大，在毫秒刻度範圍內發生，通過冷凍電鏡可獲得中等解析度（~1nm）的解析。也可以通過X-ray和NMR技術獲得原子解析度的結構解析。

冷凍電鏡獲得的生物大分子複合物的7-9Å解析度的結構信息中包含了單個蛋白質成分或結構域的生物信息，因此能夠指導形成一種完整的複合物的摺疊模型。用這種方法已獲得了大稻侏儒病毒6-8Å的結構，結合生物信息學提出了其主要衣殼蛋白的摺疊模型。

電子斷層成像技術 電子斷層成像技術可用來研究細胞器或細胞結構，以及一些巨大的超分子複合物。對於電子斷層成像技術，有兩方面很重要，第一，是使用透射電鏡進行斷層成像，獲得三維物體的二維投影像；第二是低溫保存生物樣品的天然狀態。通過對同一樣品每間隔一定角度拍攝一幅照片，通常是在-70°到+70°的角度之間，得到幾十幅代表同一結構不同角度下的二維投影像，然後對這一系列投影像對正，用加權背投影的方法獲得樣品的空間結構。然而獲得足夠的一系列傾斜樣品的斷層圖證明是對技術上的一個挑戰。主要問題是究竟需要多少斷層圖。我們獲得的斷層圖像的解析度依賴於樣品的厚度和獲得的相應投影圖像的數量。這樣，如果想獲得厚度為0.25μm樣品的分子解析度（0.5nm）的圖像，大約需要160張相同空間的投影圖。該方法顯示的是完整結構系統的靜態結構信息，而冷凍電鏡單粒子法是從成千上萬的單粒子圖象中重構出超微分子結構，是以生物分子的功能動力學為特點。樣品製備同樣很關鍵。冷凍含水技術雖說日趨成熟，但對電子斷層成像來說仍面臨挑戰：1、樣品的厚度超出了冷凍電鏡的適用範圍，這就要求有特殊的設備，採用高壓冷凍或高速冷凍（slam-freezing）2、冰凍含水樣品很難製成超薄切片，世界上只有少數幾個實驗室能做到，3、該技術需要對同一樣品進行重複照射，自組裝斷層成像技術使電子輻射累計量達最低減少對樣品的損傷。然而，這樣的保護措施（樣品不被固定也不染色）也有一定的弊端：包埋在無定型冰中的生物樣品產生的投影像對比度很低，而且隨著樣品的厚度增加而降低。為此，通過在非常規的欠焦狀態下成像已獲得較高的對比度，也就是10nm或更高。另一種解決的方法就是通過濾掉非彈性散射電子來減少電子束對樣品的損傷，對於較厚的樣品可以使用較高的加速電壓比如300KV以增加其穿透能力。

電子斷層成像技術

電子斷層成像術的主要優勢在於解決不具備周期性或全同性的生物大分子複合體系或細胞器的結構,如線粒體、高爾基體、細胞等,這些不具全同性的粒子結構是無法用其他方法解析的。通過電子斷層成像術得到的細胞結構,現在已能到5nm左右的解析度,在這個解析度下分子量大於400kD的結構可以精確定位在細胞中。

電子斷層成像技術構建的線粒體的全新結構，向傳統教科書上的觀點發起挑戰。傳統觀點認為線粒體內膜向內突出形成冠狀的嵴，而斷層成像顯示為內膜向內突起形成管腔結構。迄今為止，電子斷層成像技術已廣泛套用到快速冷凍（plung-freezing）的樣品研究中去。自從快速冷凍和製作較厚的冷凍切片成為常規技術以來，快速冷凍法已已運用到800nm厚的樣品上。分離的線粒體常以500-1000nm的大小出現，這就允許使用快速冷凍方法製備樣品由於冷凍電鏡的優越性，有望將斷層成像技術套用到高壓冷凍的組織上來。

冷凍電子斷層成像技術對於觀察處於細胞內天然狀態的生物大分子複合物的三維空間狀態有著獨特的優勢。該方法是基於對保存在玻璃樣冰中的處於天然狀態的細胞經過不同的傾斜角度進行電子顯微成像，再將這些電子顯微像進行三維重構。5-8nm的解析度圖像已經獲得，並且解析度還在不斷提高。既然許多細胞內的生命活動都是由在20-50nm範圍內的複合物來執行，那么目前的解析度足夠獲得他們的斷層圖像。然而，其他成分產生的噪音信號和細胞內各成分的密度疊加使解釋工作變得困難。最近斷層圖像數據可以在真核細胞外進行採集，斷層成像技術已開始揭示真核細胞在天然狀態下其內部結構的分子水平解析度的三維結構。這些觀察代表了幾年來在自動數據採集，圖像重構和低溫保存技術進步的一個巔峰。Baumeister小組報導了將冷凍電子斷層成像技術第一次因套用到完整的體外真核細胞上的結果。該研究描述了Dictyosteliumdiscoideum.粘菌的離散細胞特點。Dictyostelium細胞的冷凍電子斷層圖像描述了核糖體、蛋白酶proteasomes，和通過肌動蛋白相關蛋白在空間上將肌動蛋白纖維連線而形成的網路結構。

電子晶體學 X-ray晶體學與生物電鏡的結合形成電子晶體學，綜合了三維密度圖和傅立葉變換數學理論，這可追述到D.DeRosier和A.Klug對T4噬菌體尾部的螺旋結構的研究工作上[2]。通過獲得已制好的結構規則的二維晶體的高解析度電子密度圖，我們可以解析出它的原子水平結構，螺旋對稱樣品或二十面體對稱的病毒結構可用此方法獲得高解析度的結構。到目前為止。電子晶體學仍只能對二維晶體樣品的結構研究達到原子或接近原子的解析度水平[18]，要利用電子顯微學方法測定蛋白質的結構，首先必須得到在二維方向上高度有序且足夠大的蛋白質二維晶體。二維晶體的三維傅立葉變換在倒易空間中表現為一系列的衍射點,晶體的結構信息就存在於這些衍射點中。晶體結構因子的振幅可直接從電子衍射譜測出,而相位可以從電子顯微像的傅立葉變換得到,將兩者整合併進行逆傅立葉變換就獲得了晶體相應投影方向的結構密度圖。其三維重構則是通過傾轉樣品,拍攝不同轉角下的電子衍射譜和電子顯微像,獲取不同轉角下的振幅和相位信息,最後將這些信息在三維倒易空間中擬合,並加入相應的晶體學對稱,通過逆傅立葉變換得到實空間的晶體結構。

電子晶體學

自從D.DeRosier和A.Klug於1968年第一次用該技術重構出T4噬菌體尾部的三維空間結構以來[2],共有4種膜蛋白的原子解析度的結構通過電子晶體學方法確定下來,即細菌視紫紅質(bacreriorhodopsin)[18]、植物捕獲光能複合體Ⅱ(plantlightnarvestingcomplexⅡ)[19]、水通道(aquaporin)和乙醯膽鹼受體(acetylcholinereceptor)。還有一些膜蛋白得到了0.4~0.9nm解析度的三維結構,如視紫紅質(rhodopsin)、植物光系統II反應中心(plantphotosystemⅡreactioncentre)、H+ATP酶、微體谷胱轉移酶(microsomealglutathiontransferase)、蛋白轉運通道(SecYEG)、間隙連線子(gapjunction)及Na+H+轉運蛋白(NhaA)等。還有一些水溶性蛋白,如微管蛋白(tubulin)也通過電子晶體學的方法得到了高解析度(0.35nm)的三維結構。另外一大批膜蛋白或水溶性蛋白獲得了1～2nm低解析度的結構。以上高解析度的結構都是以片狀的二維晶體為對象解析出來的。但有一些蛋白並不形成這種片狀的二維晶體,而是形成螺旋對稱的管狀晶體,如肌質網鈣ATP酶及乙醯膽鹼受體等。另有一些蛋白在體內就以螺旋對稱的纖維形式存在,如肌動蛋白及一些病毒粒子(如菸草花葉病毒)。這類呈螺旋對稱的結構其優勢在於一張照片中包含了各個角度的蛋白像,因此不需要傾轉樣品,在數據收集上相對簡單。而缺點就是含有的晶胞數較少、信噪比低,解析度沒有典型的二維晶體高,至今最高解析度是乙醯膽鹼受體0.40nm解析度的三維結構。

電子晶體學一個不可比擬的優勢在於通過這種方法得到的是膜蛋白和膜相關的水溶性蛋白在膜環境中的結構信息,和X射線晶體學相比更反映生理狀態下的真實結構。下面,我們將以植物的光系統Ⅱ捕光葉綠素a/b蛋白複合體為例說明電子晶體學研究的優勢。植物的光系統Ⅱ捕光葉綠素a/b蛋白複合體(LHCⅡ)是高等植物及綠藻體葉綠體中類囊體膜上含量最多的整合型膜蛋白複合體,它最重要的生物學功能是吸收光能並傳遞到光反應中心,這是光合作用的第一階段。解析LHCⅡ的結構對於從本質上探索光合作用的過程和機理具有非常重要的意義。到目前為止,還沒有植物LHCⅡ的三維結晶化及結構解析的報導,對於該結構解析最好的結果來自於電子晶體學。Kuhlbrand等人從豌豆的葉綠體中分離純化了LHCⅡ,採用重組脂雙層法得到了大面積的高度有序的LHCⅡ的二維晶體。通過對冷凍樣品的電子晶體學分析得到了0.34nm解析度的原子模型[7],此解析度下的模型可提供大量的原子間位置關係和相互作用的信息,能幫助人們了解這個蛋白複合體光能吸收和能量傳遞的機制。