雷射掃描共聚焦螢光顯微鏡

雷射掃描共聚焦螢光顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,LSCM)是一種利用計算機、雷射和圖像處理技術獲得生物樣品三維數據、目前最先進的分子細胞生物學的分析儀器。主要用於觀察活細胞結構及特定分子、離子的生物學變化，定量分析，以及實時定量測定等。

基本介紹

• 中文名：雷射掃描共聚焦螢光顯微鏡
• 半導體雷射器：405nm（近紫外譜線）
• 掃描模組：針孔光欄等
• 基本結構：雷射光源、螢光顯微鏡等

歷史

·1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦顯微鏡技術的某些基本原理，獲得了美國的專利。

·1967年，Egger和Petran成功地套用共聚焦顯微鏡產生了一個光學橫斷面。

·1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線性關係和雷射掃描器的拉曼光譜學。

·1984年，Biorad為公司推出了世界第一台商品化的共聚焦顯微鏡，型號為SOM-100，掃描方式為台階式掃描。

·1986年MRC-500型改進為光束掃描，用作生物螢光顯微鏡的共聚焦系統。

·1987年White和Amos在英國《自然》雜誌發表了“共聚焦顯微鏡時代的到來”一文，標誌著LSCM已成為進行科學研究的重要工具。

·隨後Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相繼開發出不同型號的共聚焦顯微鏡，產品的性能不斷改進和更新，套用的範圍也越來越廣。

共聚焦掃描顯微鏡的成像原理

採用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射後發出的螢光被物鏡收集，並沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將螢光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對於焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦於照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔範圍之內，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以雷射逐點掃描樣品，探測針孔後的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉為數位訊號傳輸至計算機，最終在螢幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。

每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫切面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由於焦點處的光強遠大於非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結合，通過累加連續層次的二維圖像，經過專門的計算機軟體處理，可以獲得樣品的三維圖像。

即檢測針孔和光源針孔始終聚焦於同一點，使聚焦平面以外被激發的螢光不能進入檢測針孔。

雷射共聚焦的工作原理簡單表達就是它採用雷射為光源，在傳統螢光顯微鏡成像的基礎上，附加了雷射掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機控制來進行數位化圖像採集和處理的系統。

雷射掃描共聚焦顯微鏡基本結構

雷射掃描共聚焦顯微鏡系統主要包括掃描模組、雷射光源、螢光顯微鏡、數位訊號處理器、計算機以及圖像輸出設備等。

（1）掃描模組

掃描模組主要由針孔光欄（控制光學切片的厚度）、分光鏡（按波長改變光線傳播方向）、發射螢光分色器（選擇一定波長範圍的光進行檢測）、檢測器（光電倍增管）組成。螢光樣品中的混合螢光進入掃描器，經過檢測針孔光欄、分光鏡和分色器選擇後，被分成各單色螢光，分別在不同的螢光通道進行檢測並形成相應的共焦圖象，同時在計算機螢幕上可以顯示幾個並列的單色螢光圖象及其合成圖象。

（2）螢光顯微鏡系統

顯微鏡是LSCM的主要組件，它關係到系統的成像質量。顯微鏡光路以無限遠光學系統可方便地在其中插人光學選件而不影響成像質量和測量精度。物鏡應選取大數值孔徑平場復消色差物鏡，有利於螢光的採集和成像的清晰。物鏡組的轉換，濾色片組的選取，載物台的移動調節，焦平面的記憶鎖定都應由計算機自動控制。

雷射掃描共聚焦顯微鏡所用的螢光顯微鏡大體與常規螢光顯微鏡相同，但又有其特點：需與掃描器連線，使雷射能進入顯微鏡物鏡照射樣品，並使樣品發射的螢光到達檢測器；需有光路轉換裝置，即汞燈與雷射轉換，同時汞燈光線強度可調。

（3）常用雷射器

雷射掃描共聚焦顯微鏡使用的雷射光源有單雷射和多雷射系統，常用的雷射器包括以下三種類型：

半導體雷射器：405nm（近紫外譜線）

氬離子雷射器：457nm、477nm、488nm、514nm（藍綠光）

氦氖雷射器：543nm（綠光-氦氖綠雷射器）633nm （紅光—氦氖紅雷射器）

UV雷射器（紫外雷射器）：351 nm、364 nm（紫外光）

（4）輔助設備

風冷、水冷冷卻系統及穩壓電源。

雷射掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由雷射器發射的一定波長的激發光，光線經放大後通過掃描器內的照明針孔光欄形成點光源，由物鏡聚焦於樣品的焦平面上，樣品上相應的被照射點受激發而發射出的螢光，通過檢測孔光欄後，到達檢測器，並成像於計算機監視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點的螢光圖像組成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片。

雷射掃描共聚焦螢光顯微鏡相對普通螢光顯微鏡的優點　（1）：LSCM的圖象是以電信號的形式記錄下來的，所以可以採用各種模擬的和數字的電子技術進行圖象處理：（2）LSCM利用共聚焦系統有效的排除了焦點以外的光信號干擾，提高了解析度，顯著改善了視野的廣度和深度，使無損傷的光學切片成為可能，達到了三維空間定位；（3）由於LSCM能隨時採集和記錄檢測信號，為生命科學開拓了一條觀察活細胞結構及特定分子、離子生物學變化的新途徑：（4）LSCM除具有成像功能外，還有圖象處理功能和細胞生物學功能，前者包括光學切片、三維圖象重建、細胞物理和生物學測定、螢光定量、定位分析以及離子的實時定量測定；後者包括黏附細胞的分選、雷射細胞纖維外科及光陷阱技術、螢光漂白後恢復技術等。

雷射掃描共聚焦螢光顯微鏡的缺點

標記染料的光漂白：為了獲得足夠的信噪比必須提高雷射的強度；而高強度的雷射會使染料在連續掃描過程中迅速褪色。

光毒作用：在雷射照射下，許多螢光染料分子會產生單態氧或自由基等細胞毒素。限制掃描時間、激發光強度，以保持樣品的活性。

樣品要求

1，樣品經螢光探針標記； 2，固定的或活的組織； 3，固定的或活的貼壁培養細胞應培養在Confocal專用小培養皿或蓋玻片上； 4，懸浮細胞，甩片或滴片後，用蓋玻片封片；

5，載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，蓋玻片應光潔，厚度在0.17mm左右

6，標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發； 7，儘量去除非特異性螢光信號； 8，封片劑多用甘油：PBS混合液（9：1)