《雞傳染性鼻炎診斷技術(NY/T 538-2002)》由農業部畜牧獸醫局提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：北京市農林科學院畜牧獸醫研究所。本標準主要起草人：苗得園、陳小玲、張培君、陳葵、宋程、龔玉梅。本標準的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D、附錄E、附錄F為規範性附錄。
基本介紹
- 書名：雞傳染性鼻炎診斷技術
- 作者：中華人民共和國農業部
- 出版日期：2002年12月1日
- 語種：簡體中文
- ISBN：155066214785
- 外文名：Diagnostic Techniques for infectious Coryza
- 出版社：中國標準出版社
- 頁數：10頁
- 開本：16
- 品牌：北京勁松建達科技圖書有限公司
內容簡介,文摘,
內容簡介
《雞傳染性鼻炎診斷技術(NY/T 538-2002)》由中國標準出版社出版。
文摘
著作權頁：
3.2.2 PCR臨床樣品的預處理
將浸過棉拭子的離心管以8000 r/min～10000 r/min離心10 min，小心吸去大部分上清液，保留20 μL左右液體（若原始樣品中混有血液，可2000 r/min離心3 min～5 min，使血球沉於管底，將上清液轉到新管里，再高速離心）。經上述處理過的樣品，可開始消化，或在—20℃保存。
3.2.3 PCR臨床樣品消化
用吸頭將離心管中沉澱物與剩餘液體混合均勻，從中取1μL置於含9 μL PCR消化液的0.5 mL小離心管中（注意：做不同樣品時應換吸頭），然後壓緊離心管蓋，56℃水浴1h，然後95℃10 min，再冰浴10 min後進行PCR擴增或置—20℃保存。
3.2.4 PCR菌落樣品製備
挑取平皿上的可疑菌落，加到含10 μL蒸餾水的0.5 mL的小離心管中，壓緊管蓋，95℃加熱10 min，再冰浴10 min後進行PCR擴增或—20℃保存。
3.2.5 PCR陰陽性對照樣品製備
用10μL消化液作為陰性對照樣品，用9μL消化液加1μL已知陽性對照物作為陽性對照樣品。56℃水浴1h，然後95℃10 min，再冰浴10 min後進行PCR擴增或置—20℃保存。
3.2.6 PCR擴增
將樣品管瞬時離心，使附著於管頂、壁上的液滴沉下，然後加入15μL PCR反應液，使總體積為25 μL。再瞬時離心，然後加入50 μL礦物油覆蓋，置PCR儀上進行擴增反應。程式為94℃1 min、65℃ 1 min、72℃2 min循環25次；94℃1 nun、65℃1 min、72℃10 min循環一次。
3.2.7瓊脂糖凝膠電泳
按照附錄D製備0.7%的瓊脂糖凝膠，從各PCR反應管中分別取10μL反應產物與2μL加樣緩衝液混合均勻，然後加入到樣品孔中。初次操作時應設定DNA分子量對照，60 V～80 V穩壓電泳30 min～50 min，至加樣緩衝液的染料帶走出2 cm～3 cm時停止電泳。
3.2.8結果
在紫外檢測儀下觀察結果，必要時可拍照保存。
3.3結果判定與表示方法
陽性對照樣品應呈現一條0.5 kb的DNA帶，陰性對照樣品不應有這條帶，被檢樣品若出現與陽性對照同樣大小的一條DNA帶，則判為陽性，記作“+”，若無此帶，則判為陰性，記為“—”。陰、陽性對照應分別出現陰、陽性結果，否則，全部樣品應該重做。
4血清平板凝集試驗
4.1材料準備
4.1.1雞傳染性鼻炎平板凝集試驗抗原、陰、陽性對照血清，按說明書保存和使用，使用前與被檢血清一起恢復至室溫。
4.1.2試驗用玻板（也可用載玻片）、可調微量加樣器1個、滅菌吸頭若干、記號筆。
4.2操作程式
4.2.1 本試驗在室溫（20℃～25℃）進行。
3.2.2 PCR臨床樣品的預處理
將浸過棉拭子的離心管以8000 r/min～10000 r/min離心10 min，小心吸去大部分上清液，保留20 μL左右液體（若原始樣品中混有血液，可2000 r/min離心3 min～5 min，使血球沉於管底，將上清液轉到新管里，再高速離心）。經上述處理過的樣品，可開始消化，或在—20℃保存。
3.2.3 PCR臨床樣品消化
用吸頭將離心管中沉澱物與剩餘液體混合均勻，從中取1μL置於含9 μL PCR消化液的0.5 mL小離心管中（注意：做不同樣品時應換吸頭），然後壓緊離心管蓋，56℃水浴1h，然後95℃10 min，再冰浴10 min後進行PCR擴增或置—20℃保存。
3.2.4 PCR菌落樣品製備
挑取平皿上的可疑菌落，加到含10 μL蒸餾水的0.5 mL的小離心管中，壓緊管蓋，95℃加熱10 min，再冰浴10 min後進行PCR擴增或—20℃保存。
3.2.5 PCR陰陽性對照樣品製備
用10μL消化液作為陰性對照樣品，用9μL消化液加1μL已知陽性對照物作為陽性對照樣品。56℃水浴1h，然後95℃10 min，再冰浴10 min後進行PCR擴增或置—20℃保存。
3.2.6 PCR擴增
將樣品管瞬時離心，使附著於管頂、壁上的液滴沉下，然後加入15μL PCR反應液，使總體積為25 μL。再瞬時離心，然後加入50 μL礦物油覆蓋，置PCR儀上進行擴增反應。程式為94℃1 min、65℃ 1 min、72℃2 min循環25次；94℃1 nun、65℃1 min、72℃10 min循環一次。
3.2.7瓊脂糖凝膠電泳
按照附錄D製備0.7%的瓊脂糖凝膠，從各PCR反應管中分別取10μL反應產物與2μL加樣緩衝液混合均勻，然後加入到樣品孔中。初次操作時應設定DNA分子量對照，60 V～80 V穩壓電泳30 min～50 min，至加樣緩衝液的染料帶走出2 cm～3 cm時停止電泳。
3.2.8結果
在紫外檢測儀下觀察結果，必要時可拍照保存。
3.3結果判定與表示方法
陽性對照樣品應呈現一條0.5 kb的DNA帶，陰性對照樣品不應有這條帶，被檢樣品若出現與陽性對照同樣大小的一條DNA帶，則判為陽性，記作“+”，若無此帶，則判為陰性，記為“—”。陰、陽性對照應分別出現陰、陽性結果，否則，全部樣品應該重做。
4血清平板凝集試驗
4.1材料準備
4.1.1雞傳染性鼻炎平板凝集試驗抗原、陰、陽性對照血清，按說明書保存和使用，使用前與被檢血清一起恢復至室溫。
4.1.2試驗用玻板（也可用載玻片）、可調微量加樣器1個、滅菌吸頭若干、記號筆。
4.2操作程式
4.2.1 本試驗在室溫（20℃～25℃）進行。
