《雌激素調節仔豬睪丸支持細胞增殖的分子機制》是依託西南大學，由王鮮忠擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：雌激素調節仔豬睪丸支持細胞增殖的分子機制
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王鮮忠
- 依託單位：西南大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
睪丸支持細胞的增殖能力決定了成年動物精子生成能力和移植器官的成活時間,但雌激素如何通過受體、蛋白激酶調節睪丸支持細胞的增殖目前還不清楚。本項目以新生仔豬睪丸為研究對象，採用體內、體外模型，通過誘導細胞同步化、添加激動劑劑和抑制劑，使用免疫組化、流式細胞術、免疫共沉澱、confocal、免疫印跡、螢光定量 PCR和RNAi等技術，在確定參與細胞增殖受體的基礎上，分析ERK1/2和PI3K如何激活mTOR系統,最後分析雌激素如何通過受體、蛋白激酶調節細胞周期關鍵調控蛋白Skp2（S-phase kinase-associated protein 2，Skp2）的水平，以闡明雌激素調節支持細胞增殖的分子機制。本研究不僅可以為深入認識雄性性腺發育的分子機制，豐富生殖內分泌領域的知識提供基礎數據；而且也可以為人工調控支持細胞的增殖、延長移植器官的存活時間奠定基礎。
結題摘要
睪丸支持細胞在哺乳動物的精子生成中具有支持和營養的功能，研究其增殖能力對於提高雄性動物的生殖能力具有十分重要的理論和實踐意義。雌激素在睪丸支持細胞增殖中發揮了十分重要的作用，但其作用機制仍不清楚。本項目以仔豬為研究對象，利用體內體外模型，開展了以下幾個方面的研究： （1）仔豬睪丸支持細胞在體內的增殖與發育 以7、21 和35 d 仔豬為材料，利用細胞直接計數、免疫組織化學、流式細胞術和免疫印跡分析了仔豬睪丸支持細胞、生精細胞數量和增殖能力變化以及支持細胞的成熟分化狀況。 （2）雌激素對體外培養睪丸支持細胞周期的影響 採用流式細胞術測定了細胞周期中DNA 含量，分析了細胞周期細胞增殖指數（PI） 和S 期細胞指數(SPF) 的變化。 （3）17β－雌二醇調節支持細胞增殖的信號通路 利用體外培養的支持細胞，，通過添加各種蛋白酶的抑制劑，採用Western blot、定量PCR等技術，研究重點研究ERK、PI3K/Akt和mTOR信號通路的作用。 （4）17β－雌二醇對細胞周期調節蛋白和基因表達的影響；利用體外培養的支持細胞，採用Western blot檢測蛋白的表達水平、定量PCR檢測相關基因的表達，研究Skp2, p27Kip1, Cyclin E/CDK2和Rb表達的影響。 （5）FSH和17β-雌二醇聯合作用對SkP2表達的影響；利用體外培養的支持細胞，研究了FSH和17β-雌二醇聯合作用是否通過ERK級聯影響SkP2表達。 （6）AMPK調節雌激素誘導仔豬睪丸支持細胞增殖的機制。為了研究支持細胞中是否存在抑制細胞增殖的機制，本實驗研究了AMPK的作用。利用體外培養的支持細胞，利用激動劑和抑制劑處理細胞，miRNA測序，靶基因預測和定量PCR驗證，篩選出與AMPK表達相關的miRNA。最後通過miRNA細胞轉染，利用Western blotting檢測AMPK磷酸化活性的變化。 結論： （1）儘管在出生後1 個月左右仔豬睪丸支持細胞有較強的增殖能力，但由於這一時期的支持細胞沒有分化成熟，因此，不能支持生精細胞的進一步發育。 （2）17β- 雌二醇對細胞周期的調節呈現一定的時間- 劑量依賴性，cAMP 和ERK1/ 2 級聯參與了這一過程。 （3）17β-雌二醇通過ERβ 激活cAMP和ERK，通過GPR30、SRC影響PI3K/Akt激活，ERK和PI3K/Akt
