《甲狀腺素調節仔豬睪丸支持細胞增殖的分子機制》是依託西南大學，由孫燕擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：甲狀腺素調節仔豬睪丸支持細胞增殖的分子機制
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：孫燕
- 依託單位：西南大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
睪丸支持細胞的適度增殖不僅決定了成年動物精子生成能力,而且也是睪丸發育和精子發生啟動及維持所必須的，但甲狀腺素如何通過受體、蛋白激酶調節睪丸支持細胞增殖與分化目前尚不清楚。本項目擬以仔豬睪丸為研究對象，採用體內、體外模型，通過誘導支持細胞同步化、添加激動劑和抑制劑，使用免疫組化、流式細胞術、免疫印跡、螢光定量 PCR 和RNAi等技術，在確定參與細胞增殖調節的受體的基礎上，分析Src-Erk1/2 和PI3K/Akt/mTOR在睪丸支持細胞增殖調節中的信號傳導，最後分析甲狀腺素如何通過受體、蛋白激酶調節細胞周期關鍵調控蛋白Rb的磷酸化水平，以闡明甲狀腺素調節支持細胞增殖的分子機制。本研究將為深入認識雄性性腺發育的分子機制，豐富生殖內分泌領域的知識提供基礎數據。
結題摘要
睪丸支持細胞在哺乳動物的精子生成過程中具有重要的支持和營養功能，研究其增殖分化調節機制對於提高雄性動物的決定了成年動物的生殖能力具有十分重要的理論和臨床診療意義。近年來的研究發現，甲狀腺素在睪丸支持細胞增殖/分化調節中發揮了十分重要的作用，但其具體的作用機制尚不清楚。本項目以仔豬睪丸支持細胞為研究對象，利用體內外模型，開展了以下幾個方面的研究： （1）甲狀腺素受體在不同發育階段仔豬睪丸中的表達：以0周、3周、5周和12月齡的全同胞或半同胞仔豬睪丸為材料，利用免疫組化、免疫印跡和螢光定量PCR分析了不同發育階段中TRα的表達；同時採用流式細胞術測定了睪丸支持細胞、生精細胞數量和增殖能力變化以及支持細胞的成熟分化狀況。 （2）甲狀腺素對體外培養睪丸支持細胞增殖的影響：利用體外培養的支持細胞，分別添加不同濃度的T3 (0.1, 1, 10, 100, 1000 nM) 培養12h，利用CCK8和流式細胞術檢測細胞的數量和增殖。再用T3（(100 nM)）刺激支持細胞12, 24, 36和48h，利用CCK8和流式細胞術檢測細胞的數量和增殖。 （3）甲狀腺素調節仔豬睪丸支持細胞體外增殖的作用機制：我們選取體外培養的支持細胞作試驗模型，重點研究T3通過PI3K/Akt信號通路調節SC增殖/分化的作用機制。以不添加激素為對照組，設定FSH組，T3組，以及FSH+ T3組。利用CCK8和流式細胞術檢測細胞的數量和增殖，利用Western blot檢測蛋白的活性，利用定量PCR檢測相關基因的表達，通過添加各種蛋白酶的抑制劑反向證明信號通路的作用。 結論： （1）隨著仔豬睪丸支持細胞的發育，其增殖能力在3周齡達到最強，隨後逐漸降低。TRα1的表達量則隨睪丸的發育逐步降低，表明甲狀腺素可能參與支持細胞增殖/分化的調節。 （2）T3對仔豬睪丸支持細胞增殖具有調節作用，其調節呈現一定的時間- 劑量依賴性，適宜的刺激濃度為100 nM; T3對體外培養的支持細胞適宜的反應時間為24h。 （3）T3通過與其受體TRa1結合，繼而引起PI3K / Akt級聯的信號路徑將其抑制效應傳導到下游，引起P27的表達增強，細胞周期相關蛋白如cyclinA2，cyclinD1，cyclinE1，Skp2的表達下調，最終引起PCNA蛋白表達量下降，迫使睪丸支持細胞從細胞周期退出並開始分化。
