金黴素（chlortetracycline）金色黃色晶體粉末，由金色鏈黴菌（Streptomyces aureofacieus）發酵產生，發酵液經酸化、過濾得沉澱物，溶解於乙醇後經酸析得粗品，經溶解、成鹽得鹽酸鹽結晶。
本品作用及抗菌譜與四環素相同，但在四環素類中不良反應最大(金黴素>土黴素>四環素)。
基本介紹
化合物簡介,分子結構數據,合成方法,用途,相關藥品說明,藥品名稱,所屬類別,作用類別,適應症,用法用量,不良反應,禁忌,注意事項,藥物相互作用,藥理作用,專家點評,層析檢驗,檢驗原理,材料方法,結果討論,
化合物簡介
分子結構數據
1、 摩爾折射率：113.91
2、 摩爾體積（cm/mol）：281.5
3、 等張比容（90.2K）：893.2
4、 表面張力（dyne/cm）：101.9
5、 極化率（10cm）：45.15
合成方法
由金色鏈黴菌發酵產生，發酵經酸化、過濾得沉澱物，溶解於乙醇後經酸析得粗品，再進行溶解、成鹽得其鹽酸鹽結晶。
用途
金黴素對革蘭陽性菌和陰性菌均有抑制作用，可治療畜禽的傷寒、白痢等病。同時也可作為促進生長劑，用於豬飼料。用於10周齡以下的肉雞飼料，用量20-50g/t，停藥期7天；用於2月齡以下的豬飼料，用量為25-75g/t，停藥期7天。
相關藥品說明
藥品名稱
【通用名稱】鹽酸金黴素軟膏
【英文名稱】 Chlortetracycline Hydrochloride Ointment
【漢語拼音】 Yan Suan Jin Mei Su Ruan Gao
所屬類別
化藥及生物製品 >> 抗微生物藥 >> 抗細菌藥 >> 抗生素類
作用類別
本品為皮膚科用藥類非處方藥藥品。
適應症
用於膿皰瘡等化膿性皮膚病，輕度小面積燒傷及潰瘍面的感染。
用法用量
局部外用。取本品適量，塗於患處，每日2-3次。
不良反應
偶見皮膚紅腫、皮疹等過敏反應。
禁忌
對其他四環素類抗生素過敏者禁用。
注意事項
1、孕婦、哺乳期婦女和小兒避免使用。
2、避免接觸眼睛和其他黏膜（如口、鼻等）。
3.用藥部位如有燒灼感、瘙癢、紅腫等情況應停藥，並將局部藥物洗淨，必要時向醫師諮詢。
4.久用易產生耐藥性。使用不宜超過7日，如未見好轉，應諮詢醫師。
5.對本品過敏者禁用，過敏體質者慎用。
6.本品性狀發生改變時禁止使用。
7.請將本品放在兒童不能接觸的地方。
8.兒童必須在成人監護下使用。
9.如正在使用其他藥品，使用本品前請諮詢醫師或藥師。
藥物相互作用
如與其他藥物同時使用可能會發生藥物相互作用，詳情請諮詢醫師或藥師。
藥理作用
專家點評
由於其水溶液不穩定，在中性或鹼性溶液中更易被破壞，故已於1982年將片劑、糖粉劑、顆粒劑、注射劑淘汰，現多用作外用製劑的原料，如製成眼膏供眼部感染用。
層析檢驗
檢驗原理
DNA金黴素是一種高效廣譜抗生素，對多種病原菌有較強的抑制作用，常用於動物各種傳染性疾病的治療。但其在動物肉、奶、蛋等食品中的殘留嚴重威脅人體健康，能引起再生障礙性貧血和粒狀白細胞缺乏症等疾病，低濃度的藥物殘留還會誘發致病菌的耐藥性。歐盟、美國等許多國家已明確禁止CAP用於生產動物源性食品，並制定了嚴格的限量標準。加入WTO後，農、獸藥殘留日益成為各已開發國家限制中國農副產品出口的技術壁壘。2002年1月30日，歐盟委員會以從中國進口的蝦仁中檢出金黴素為由，發布2002/69/EC決議，禁止中國動物源性食品進口，直接造成中國水產品出口6億多美元的經濟損失。
金黴素等半抗原（分子量<1000Da）的檢測方法，通常採用酶聯免疫吸附反應（ELISA）及高效液相色譜（HPLC）及氣-質聯用（GC-MS）等方法。然而，這些方法需要較長的實驗時間及相應昂貴的實驗設備，主要被限制在實驗室中使用。隨著人們對食品安全的日益重視和進出口貿易的高速增長，迫切需要一種能快速、穩定地檢測農、獸藥殘留的方法。膠體金免疫層析試條因其使用方便已被廣泛用於小分子物質的診斷檢測，已經開發出用於鏈黴素、磺胺嘧啶等農、獸藥殘留檢測的試紙條。本實驗開發了一種快速檢測金黴素殘留的免疫層析試紙條，具有靈敏度高，操作快捷，不需要附加設備等優點，適用於加工企業對原輔材料驗收，人員用藥，成品分析以及養殖場對投入品的檢測等工作。
材料方法
血漿蛋白1.1材料 氯金酸（HauCl4·4H2O）、金黴素標準品、牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000購於SIGMA公司；抗金黴素單克隆抗體（MAb），購於Biodesign公司（免疫原為KLH與金黴素的偶聯物，鼠源性）；水溶性碳二亞胺（EDC）、金黴素琥珀酸鈉鹽，購於Fluka公司；羊抗鼠IgG購於北京鼎國生物技術有限公司；金黴素ELISA檢測試劑盒購於EURO-DIOGNOSTICA公司；Bradford蛋白定量試劑盒購於Bio-Rad公司；BioJet XYZ3000型點膜儀購於美國BioDot公司；硝酸纖維素膜（NC）、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊購於Millipore公司。
1.2膠體金的製備及抗金黴素Mab的金標記 膠體金顆粒的大小平均為30nm，參照文獻製備膠體金顆粒，在100ml去離子水中加入1%檸檬酸三鈉1ml，煮佛後迅速加入1%氯金酸1ml，繼續煮佛10min，冷卻後，4℃下保存備用。
取已製備好的膠體金溶液100ml，用0.1mol/L碳酸鉀溶液調pH到8.0。邊攪拌邊加入抗金黴素MAb1.5mg，攪拌20min，再逐滴加入2ml25mg/ml聚乙二醇20000（PEG20000），攪拌15min。20000 r/min離心15min，棄上清液，加入10mlpH7.4PBS緩衝液（含0.4mg/mlPEG）清洗2次。將沉澱用5ml含2%BSA的PBS緩衝液（pH7.4）溶解，用0.22μm無菌過濾器過濾後，4℃保存備用。
1.3樣品製備 金黴素標準樣品配製以甲醇配成100μg/ml標準貯液，後以超純水稀釋成各濃度梯度。
肉類樣品預處理取10g均質過的試樣，加入10mlPBS，37℃混合保溫90 min後，3000r/min離心20 min，收集上清液備用。
牛奶樣品預處理取5ml新鮮牛奶，放入離心管中，10℃3500r/m離心10 min，吸除上層的脂肪層，取去脂牛奶用PBS適當稀釋後備用。
將上述試樣處理液與各種濃度的金黴素標準品按不同體積比混合成所需濃度的試樣。部分實際待測試樣的處理方法參考荷蘭EURO-DIAGNOSTICA金黴素檢測試劑盒產品試樣處理方法。
血清
血清1.4金黴素全抗原的合成 包被抗原為金黴素與BSA的偶聯物（CAP-BSA），其合成方法為活性酯法及疊氮法，參見文獻，其中活性酯法為：先將20mg氯毒素琥珀酸鹽、15mgEDC及30mgBSA混合溶於1ml Tris緩衝液中，0~4℃下避光攪拌1h，再加入5mgEDC，在0℃下攪拌反應12h，靜置過夜後，後用Tris緩衝液透析3d。
將合成的CAP-BSA全抗原稀釋成100μg/ml（蛋白濃度），後做200~300nm波長的紫外掃描，參照楊利國介紹的計算方法測算偶聯比，即CAP與載體蛋白BSA的摩爾比。其中BSA濃度以BRADFORD蛋白定量試測定。
用ILISA試劑盒檢測金黴素濃度，操作方法參見產品說明書。在450nm波長處測A值，計算抑制率：
抑制率=B/B0×100%B0為不含待測試樣中金黴素的吸光值，B為含待測試樣中金黴素吸光值。
1.5試紙條組裝 用點膜機把適當濃度的CAP-BSA及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分別作為檢測線（T）和控制線（C），在37℃烘箱乾燥8h。以同樣方法，將製備好的金標記CAP單克隆抗體包被在膠體金結合墊上。
試紙條組成為一個PVC背板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用帶MARK膠帶繞背板覆蓋在樣品墊、膠體金結合墊及吸水墊上。用切割機將貼好的板切割成3mm寬的條，放入帶乾燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。
1.6檢測方法 將CAP檢測試紙條帶MARK線的一端插入裝有待測試樣的容器中，使試樣溶液沿膜從下往上移動。5min以後，即可判讀結果。
結果討論
結構2.1檢測結果的判讀試紙條的組成如圖1所示。當樣品墊端放入檢測試樣時，由於毛細作用液體向前移動。到達T線時，試樣中的金黴素與固定在T線上的CAP-BSA複合物競爭結合抗金黴素MAb-膠體金複合物，若試樣中金黴素濃度小於1ng/ml，則膠體金結合墊中的抗金黴素MAb-膠體金複合物與T線上CAP-BSA及C線上羊抗鼠IgG大量結合，T線呈色與c線相近，結果為陰性；若試樣中金黴素的濃度大於1ng/ml，則抗金黴素MAb-膠體金複合物基本上與檢測試樣中的金黴素結合，不能與T線上的CAP-BSA結合，因此T線將比c線淺很多或完全看不到線，而且試樣中金黴素濃度越高T線顯色越淺，結果為陽性。如檢測正確進行的話，控制線總會顯示紅色線條。
2.2CAP-BSA人工抗原合成本試紙條檢測線所用的包被抗原為CAP-BSA偶聯物，由本實驗室人工合成。偶聯反應後所得產物經紫外光譜分析，參照文獻所介紹的方法計算其偶聯比率。多次實驗所得抗原的偶聯比率在1：10~40左右，部分數據見表1。由表1可以看出，BSA與CAP偶聯後最大吸收峰都發生藍移，可能是其分子結構發生變化及環境極性增大的原因。對金黴素與BSA的偶聯是否成功，還採用競爭抑制ELISA檢測來判斷。按梯度稀CAP-BSA偶聯物，後由CAP-BSA與CAP標準品競爭結合金黴素抗體。
金黴素標準品對不同濃度CAP-BSA的抑制率，隨著CAP-BSA稀釋倍數的升高（CAP-BSA含量減少）酶標金黴素標準品對其的抑制率升高。即CAP-BSA與酶標金黴素競爭結合金黴素抗體，表明抗原偶聯是成功的。本實驗還對CAP抗原的合成方法採用了活性酯法與疊氮法，並比較其對T線的影響。由於疊氮法合成的疊氮化合物為淡黃色物質，干擾T線顯色，因此不適用作為檢測線的包被抗原。而活性酯法合成的偶聯物CAP-BSA1~3，以相同的BSA濃度包被T線，控制線都能與金標記的CAP抗體反應出現明顯的紅色線條，適合做包被抗原。並發現其不同結合比對檢測的靈敏度有一定影響，見試紙條的調試部分。
脂肪組織2.3試紙條的調試將不同半抗原結合比、不同濃度的CAP-BSA和不同A值的金黴素單克隆抗體-膠體金複合物分別包被在硝酸纖維素膜和膠體金結合墊上，反覆調試，使最終的靈敏度達到所需的要求。其用量如下：金黴素單克隆抗體-膠體金複合物採用A值為40（噴量2μg/cm）的包被量，檢測線CAP-BSA用量為0.1mg/ml（噴量0.75μl/cm），控制線羊抗鼠IgG用量為1mg/ml（噴量0.75μl/cm）。調試結果表明採用不同pH值5、6、7、8、9、10的樣品墊對試劑條的靈敏度沒有產生明顯影響。將硝酸纖維素膜用各種不同配比的溶液做封閉，發現試劑條的C、T線顯色都變淺，但對靈敏度和特異性沒有明顯影響，所以最終製備試劑條時沒有採用封閉的方案。經過比較發現，用同樣的C、T線濃度、抗體-膠體金複合物A值和同樣的包被量，採用12μm和5μm這兩種不同比例的蔗糖和海藻糖，會對膠體金複合物從膠體金結合墊上的釋放能力產生影響，在一定範圍內，加入的蔗糖和海藻糖的比例越高，膠體金複合物釋放得越快。
採用半抗原偶聯率比較高的CAP-BSA做成的試劑條靈敏度更高，這可能同偶聯比率高的CAP-BSA與金黴素單克隆抗體-膠體金複合物發生反應的能力更強有關。但過高的半抗原結合比並不符合C、T線顏色對比這種判斷，反而使靈敏度下降。本試紙條金黴素的最低檢測水平（LDL）的判斷標準是當檢測線比控制線的顏色明顯淡時，試樣中金黴素的含量為1mg/ml。當試樣中的CAP濃度大於5ng/ml時，檢測線完全消失；當CAP濃度小於0.5ng/ml時，檢測線與控制線在肉眼下沒有明顯區別。本試紙條的LDL可達到1ng/ml。檢測限如再降低，容易出現假陰（陽）性的結果。由於其使用主要是在生產場所現場大批量初篩時定性檢測，此靈敏度可以滿足實際的篩選需要，如需可靠的定量結果還需在實驗室里做ELISA、HPLC等進一步檢測。
2.5檢測的特異性將金黴素琥珀酸鈉，甲碸黴素，磺胺二甲基嘧啶，四環素，青黴素，鏈黴素6種抗菌素溶於PBS（pH7.4，0.01mol/L），配成不同濃度，然後用試紙條檢測。結果如圖3所示，金黴素琥珀酸鈉及金黴素在低濃度下即不出現紅色T線。而後5者（類似物）即使在濃度大於100ng/ml時，也能見明顯的T線，可見與不同抗菌素的交叉反應很低（因定性檢測不能給出交叉率的確切數值）。由於T線包被抗原是以琥珀金黴素鈉鹽偶聯BSA而成，因此金黴素琥珀酸鈉與金黴素的這種交叉反應是在意料之中的。因此免疫層析試紙條可以通過觀察試紙條上檢測線的有無及顏色變化進行定性檢測，對金黴素具有較高的特異性。2.6穩定性試驗用同一批次不同試紙條檢測同一樣品，及用不同批次試紙條測定同一樣品，其質控線、測試線的顯色時間及顏色深淺和最終結果判讀基本相同。利用該試紙條對含不同濃度金黴素殘留的蝦肉提取液試樣進行檢測並與ELISA的檢測結果比較，總共檢測50份（陽性30份，陰性20）。試紙條以1ng/ml為判斷限值，沒有出現假陽性及假陰性，檢測結果與ELISA結果完全相符。如把檢測限值再降低則易出現假陽性的結果，不能達到試紙條檢測穩定性的要求。
毛細血管免疫膠體金技術是20世紀70年代初期由Faulk和Taylor始創，最初用於免疫電鏡技術。金標記技術常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術用於體外快速診斷的一個重要發展方向，是在現代單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的新型檢測技術。該技術發展迅速，已經在臨床診斷特別是床邊檢測（POCT）中得到了廣泛套用，如傳染病、早孕、癌症等的檢測。已有些非臨床檢測的套用，如毒素、藥殘留、環境監測等。我們研製的金黴素膠體金免疫層析檢測試紙條可用於飼料、水產類、牛奶等的檢測，最低檢測含量（LDL）達到1ng/ml。相對於使用ELISA方法檢測金黴素樣品至少需要24h，費用約為300元/個，試紙條只需10min就可出結果，費用低廉，而且不需要附加實驗設備，能滿足養殖場所和加工企業對原輔材料、人員用藥及產品初篩等的檢測需要。但由於實驗樣品來源有限，檢測試紙條的各種參數，需在擴大樣品範圍與數量條件下做進一步的驗證。
主要質量指標
金黴素含量：15%/20% 四環素含量：小於1.2%/1.6% 蛋白質含量：20-50% 脂肪含量：2-4% 糖含量：小於2% 灰分：小於40% 水分含量：小於8% 重金屬含量：小於20ppm 砷鹽含量：小於2ppm差向金黴素含量：小於0.9%/1.2% 酸鹼度：5.0-7.5 粒度：250微米80%通過（粉狀）;250-850/90%通過（粒狀） 性狀：棕色至深棕色
飼企用途
金黴素為飼料添加劑抗生素。效能：1. 飼用金黴素能促進畜禽生長發育，提高飼料報酬率30%以上，對0-8周齡雛雞可提高育雛率6.23%，增重11.94%，可預防金黴素敏感菌。加在雛雞仔雞的飼料中可以促進生長發育，縮短育成期，提高育成率。 2. 對金黴素敏感菌能起抑制作用，小劑量添加可以預防疾病， 增大劑量可起治病作用。3. 低劑量添加即可達到促進腸道吸收功能，從而提高飼料轉化率。4. 本品是一種安全性高的抗菌素，只以低濃度添加就能產生效能，而擴大18倍劑量也不產生毒副作用。長期使用，長期有效，不產生抗藥性。
念珠菌
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