《金麗假交替單胞菌中密度感應淬滅酶及其生理功能研究》是依託中國海洋大學，由於敏擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：金麗假交替單胞菌中密度感應淬滅酶及其生理功能研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：于敏
- 依託單位：中國海洋大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
N-醯基高絲氨酸內酯（N-acylhomoserine lactone, AHL）依賴的密度感應（quorum sensing, QS）與許多致病菌毒力因子的表達密切相關。密度感應淬滅作用（quorum quenching, QQ）通過降解AHL類信號分子，阻斷致病菌的QS通路，從而降低或完全抑制其致病性。本項目擬對金麗假交替單胞菌JG1中的2個QQ酶—AHL醯基轉移酶進行異源表達及純化，分析重組酶催化AHL後的降解產物及底物特異性；檢測其對AHL的催化效率，揭示其酶學性質並比較兩者的異同；分析其催化活性中心並檢測不同環境因子對其表達量的影響，探究其對AHL類信號分子的降解機制；比較AHL醯基轉移酶差異表達對菌株JG1生長、生物活性及蛋白表達調控的影響，闡明其在菌株JG1中的生理功能。通過以上研究，拓展對海洋細菌中QQ作用的認識，為水產養殖病害的新型環境友好型防治手段的開發套用奠定基礎。
結題摘要
金麗假交替單胞菌JG1具有密度感應淬滅活性，在其基因組中發現存在有2個潛在的新型密度感應淬滅酶基因pfmA和pfpA。通過對這兩個基因進行序列分析，發現其與已知的AHL醯基轉移酶蛋白序列一致性均不超過35%，且其均屬於盤尼西林G 醯基轉移酶家族，具有N端水解酶超家族的典型特徵，即蛋白表達後經過翻譯後修飾可形成兩個亞基。根據基因序列成功構建了異源表達菌株並獲得了純化的重組蛋白，對其酶學活性進行檢測，結果表明這兩個蛋白均為AHL醯基轉移酶，能夠斷裂C12-HSL的醯胺鍵形成產物HSL。PfmA和PfpA蛋白的最適反應溫度分別為30℃和40℃，最適pH值均為7.0。SDS能夠使PfmA和PfpA完全失活。PfmA和PfpA蛋白均對長鏈的AHL信號分子具有降解活性，但兩者的底物範圍略有差異，PfmA能降解C10-HSL而PfpA不能。PfmA不能降解盤尼西林G，但可以降解氨苄盤尼西林。高度保守的Ser256是PfmA的催化活性位點。PfmA能夠降低銅綠假單胞菌的毒力因子胞外蛋白酶和綠膿菌素的分泌，又可提高被銅綠假單胞菌侵染的鹵蟲的存活率。在菌株JG1培養液中添加C12-HSL能夠促進JG1生長量增加，提高生物被膜產量，基因pfmA表達量上調，pfpA表達量下調，但對菌株的還原糖利用情況、幾丁質酶活以及抑菌活性沒有影響。通過轉錄組和蛋白質組測序及分析，菌株JG1中與胺基酸轉運和代謝、轉錄和翻譯、信號轉導、無機鐵的轉運和代謝相關的功能基因表達量較高，表明菌株JG1具有活躍的代謝特徵及對外界環境變化快速回響的能力。通過基因的差異表達分析，添加信號分子C12-HSL顯著影響了菌株JG1的乙醛酸循環，轉錄組和蛋白質組分析均檢測到蘋果酸合酶的表達量受到顯著抑制，並通過體外實驗驗證了在添加信號分子的條件下菌株JG1中蘋果酸合酶和烏頭酸水合酶的活性顯著降低。由此可知，儘管菌株JG1不產生信號分子，但其體內的AHL醯基轉移酶能夠降解外源的AHL信號分子，從而影響菌株的生長代謝過程。對菌株JG1中AHL醯基轉移酶生理功能的研究有助於進一步為密度感應淬滅技術套用於水產養殖業病害防控奠定理論基礎。
