金玉蘭酶製劑

簡介

隨著國家對食品安全問題的關注和部分乳製品企業2010年無抗奶目標的提出，抗生素殘留問題成為影響乳製品安全的重要因素之一。目前，青黴素作為β- 內醯胺類藥物是治療牛乳腺炎的首選藥物，是牛奶中最常見的殘留抗生素。由於國內多數乳品企業對抗生素殘留超標的牛乳採取降價收購的原則，出於經濟利益的驅動，一些不法奶站為了謀求自己的經濟利益，人為的使用一些生物製劑去降解牛乳中殘留的抗生素，生產人造“無抗奶”。2005年至今，已有數家公司公開宣稱出售分解牛乳中殘留抗生素的解抗劑。迄今為止，還沒有針對這種人造“無抗奶”的相應檢測方法、檢測標準，無法從源頭上監測、把控原奶質量。奶製品中三聚氰胺問題出現後，檢科院按照國家局科技司的安排，對奶製品中可能的添加物進行了調查。經過前期的調研工作，初步判斷市售解抗劑的主要成分是β-內醯胺酶，它是由革蘭氏陽性細菌產生和分泌的，可選擇性分解牛奶中殘留的β- 內醯胺類抗生素。β-內醯胺酶為我國不允許使用的食品添加劑,該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的抗生素。β-內醯胺酶能夠使青黴素內醯胺結構破壞而失去活性，導致青黴素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力，給消費者的身體健康帶來危害。微生物方法和理化方法均利用β-內醯胺酶能夠裂解青黴素的β-內醯胺環形成青黴噻唑酸的原理檢測乳製品中是否添加解抗劑。

方法

微生物方法 1 材料 1.1 菌株藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001購自國家醫學菌種保藏管理中心，在營養瓊脂上傳代培養備用。 1.2 培養基營養瓊脂培養基、抗生素檢測用培養基Ⅱ（低PH）購自陸橋。 1.3 試劑試驗用10U青黴素藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司；舒巴坦、青黴素G、 β-內醯胺酶標準品、生鮮牛乳抗生素分解劑、脫脂奶粉、生理鹽水 1.4 主要儀器牛津杯（外徑8mm） 2 方法 2.1 預試驗 2.1.1 抗生素檢測用培養基製備 90mm培養皿鋪10ml抗生素檢測用培養基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黃微球菌）。 2.1.2 生鮮牛乳抗生素分解劑活性分析將10U青黴素藥敏紙片均勻貼在抗生素檢測用培養基表面，其中3片紙上滴加20ul不同稀釋度的抗生素分解劑（500萬U/ml，50萬U/ml，5萬U/ml），同時做生理鹽水和青黴素藥敏紙片對照。37℃培養18-22小時。測量抑菌圈直徑。將不同稀釋度的抗生素分解劑保存於4℃。10天后重複試驗。 2.1.3 青黴素G濃度的選擇在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul含有不同濃度（0IU/ml，0.005IU/ml，0.05IU/ml，0.5IU/ml，5IU/ml）青黴素G的生理鹽水，37℃培養18-22小時。測量抑菌圈直徑，以確定青黴素G使用濃度。 2.1.4 β-內醯胺酶對菌生長的影響在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul含有不同濃度（0U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml，50萬U/ml，75萬U/ml，125萬U/ml，250萬U/ml）β-內醯胺酶的生理鹽水，37℃培養18-22小時。觀察抑菌圈情況。 2.1.5 β-內醯胺酶對青黴素抑菌效果的影響在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有0.5ug/ml青黴素G和不同濃度β-內醯胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脫脂奶，37℃培養18-22小時。觀察抑菌圈情況。將不同稀釋度的抗生素分解劑保存於4℃。10天后重複試驗。 2.1.6 脫脂奶對實驗效果的影響使用10%（w/v）脫脂奶代替生理鹽水重複2.1.3、2.1.4、2.1.5實驗。觀察實驗結果。 2.1.7 舒巴坦濃度的選擇（未完成，實驗參數待驗證）有實驗表明，在10%脫脂奶中添加12.5-800ug/ml舒巴坦進行測試發現，含有200ug/ml舒巴坦的脫脂奶在抗生素檢測用培養基上不產生抑菌圈；含有25ug/ml舒巴坦可有效抑制10%脫脂奶中400U/mlβ-內醯胺酶對0.5ug/ml青黴素G的分解作用。在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有不同濃度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脫脂奶，37℃培養18-22小時。觀察是否產生抑菌圈，以確定舒巴坦最高可適用濃度。在青黴素G濃度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高適用濃度（～200ug/ml）確定的基礎上，在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有0.5ug/ml青黴素G、400U/mlβ-內醯胺酶（高於推薦使用濃度100倍）和不同濃度舒巴坦（0ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml）的10%脫脂奶，37℃培養18-22小時。觀察產生抑菌圈情況，以確定舒巴坦最終適用濃度。 2.1.8 脫脂奶中β-內醯胺酶的測定（未完成，實驗參數待驗證）在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有不同成分的10%脫脂奶（添加成分見表1），37℃培養18-22小時，觀察抑菌圈情況。表1 編號 0.5ug/ml青黴素G 400U/mlβ-內醯胺酶 25ug/ml舒巴坦結果預測（是否產生 \ 抑菌圈） 1 + －－有 2 + － + 有 3 + + －無 4 + + + 有在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有不同成分的10%脫脂奶（添加成分見表1），37℃培養18-22小時，觀察抑菌圈情況。 2.1.9 β-內醯胺酶檢測限的測定（未完成）在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有0.5ug/ml青黴素、25ug/ml舒巴坦和不同濃度β-內醯胺酶（0.4U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml）的10%脫脂奶，37℃培養18-22小時，觀察抑菌圈情況。 2.2 牛奶樣品中β-內醯胺酶的測定在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有不同成分的10%脫脂奶（添加成分見表2），37℃培養18-22小時，觀察抑菌圈情況。同時做脫脂奶中β-內醯胺酶的測定。表2 編號 0.5ug/ml青黴素G 400U/mlβ-內醯胺酶 25ug/ml舒巴坦抑菌圈 1 + －－有(含抗生素) 2 + － + 有 3 + + －無(不含抗生素) 4 + + + 有 5 －－ + 無與1號比直徑差異結果預測≤3mm 含β-內醯胺酶 ≥3mm 不含β-內醯胺酶 3 實驗結果與分析 3.1 預實驗結果與分析 3.1.1 生鮮牛乳抗生素分解劑活性結果觀察與分析第一次實驗 10天后第二次實驗青黴素對照第一次實驗5萬U/ml抗生素分解劑部分分解青黴素，與青黴素對照組比較抑菌圈明顯變小；50萬U/ml抗生素分解劑可以完全分解青黴素，不產生抑菌圈。 10天后第二次實驗50萬U/ml抗生素分解劑部分分解青黴素，與青黴素對照組比較抑菌圈明顯變小。第一次實驗和第二次實驗結果比較，抗生素分解劑活性下降至少1個數量級。 3.1.2 青黴素G濃度的選擇 0.5IU/ml青黴素產生抑菌圈約為22mm，符合實驗要求。 3.1.3 β-內醯胺酶對菌生長的影響極高濃度β-內醯胺酶不影響菌生長。 3.1.4 β-內醯胺酶對青黴素抑菌效果的影響第一次實驗結果 10天后第二次實驗結果第一次實驗中，4U/mlβ-內醯胺酶即可部分分解0.5IU/ml青黴素，與對照組比較抑菌圈明顯減小。 10天后第二次實驗，200U/mlβ-內醯胺酶可部分分解0.5IU/ml青黴素，與對照組比較抑菌圈明顯減小。但4U/mlβ-內醯胺酶組產生的抑菌圈與對照組比較無明顯區別。通過第一次實驗和第二次實驗結果比較，說明抗生素分解劑活性下降

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