醋酸胸腺五肽規模化製備方法

《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》是深圳翰宇藥業股份有限公司於2013年6月19日申請的發明專利，該專利的申請號為2013102432024，公布號為CN103288923A，授權公布日為2013年9月11日，發明人是趙忠衛、潘俊鋒、馬亞平、袁建成。

《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》涉及多肽製備領域，特別涉及胸腺五肽規模化製備方法。採用如下步驟：獲得Tyr-樹脂；以胺基酸為第一原料，取Tyr-樹脂經第一逐步偶聯進行第一批次固相合成，獲得第一肽片段-樹脂，分別收集逐步偶聯的反應液備用；以反應液為第二原料，取Tyr-樹脂經第二逐步偶聯進行第二批次固相合成，獲得第二肽片段-樹脂；補充胺基酸作為第三原料，取Tyr-樹脂經第三逐步偶聯進行第三批次固相合成，獲得第三肽片段-樹脂；合併第一肽片段-樹脂、第二肽片段-樹脂和第三肽片段-樹脂，裂解，純化即得。該方法的胺基酸利用率達到67.8%以上，顯著提高了胺基酸利用率。

2016年12月7日，《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。

基本介紹

• 中文名：醋酸胸腺五肽規模化製備方法
• 公布號：CN103288923A
• 公布日：2013年9月11日
• 申請號：2013102432024
• 申請日：2013年6月19日
• 申請人：深圳翰宇藥業股份有限公司
• 地址：廣東省深圳市南山區高新技術工業園中區翰宇生物醫藥園辦公大樓四層
• 發明人：趙忠衛、潘俊鋒、馬亞平、袁建成
• Int.Cl.：C07K7/06(2006.01)I、C07K1/16(2006.01)I、C07K1/04(2006.01)I
• 代理機構：深圳市深佳智慧財產權代理事務所（普通合夥）
• 代理人：唐華明
• 類別：發明專利

專利背景

胸腺五肽是胸腺分泌物的一種，胸腺生成素Ⅱ的有效部分。胸腺生成素Ⅱ是從胸腺激素中分離出來的單一多肽化合物，由49個胺基酸組成，而其中由5個胺基酸組成的肽鏈片段，卻有著與胸腺生成素II相同的全部生理功能，所以就把這個五肽片段稱為胸腺五肽。

胸腺五肽由精氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸、纈氨酸、酪氨酸五種胺基酸組成。其化學名稱為N-〔N-〔N-〔NL-精氨醯-L-賴氨醯〕-L-α-天冬氨醯〕-L-纈氨醯〕-L-酪氨酸。分子式：C₃₀H₄₉N₉O₉。分子量：679.77。

胸腺五肽的作用之一是誘導T細胞分化。它可選擇性地誘導Thy-1-的前胸腺細胞轉化為Thy-1+的T細胞。其T細胞分化作用由胞內cAMP水平升高介導。胸腺五肽的另一基本作用是對成熟外周血T細胞的特異受體結合，使胞內cAMP水平上升，從而誘發一系列胞內反應，這也是它免疫調節功能的基礎。在正常機體狀態下胸腺五肽顯現免疫刺激作用，能顯著增高脾淋巴細胞的E玫瑰花結形成率及轉化率，對免疫應答的初次或再次反應的不同階段都有增強作用，能增多IgM類型和IgG或IgA類型的抗體形成細胞。胸腺五肽還可增強巨噬細胞的吞噬功能，增加多形核嗜中性白細胞的酶和吞噬功能，升高循環抗體含量，增強紅細胞免疫功能。胸腺五肽能活化CD4和CD8陽性細胞，使專一的Tc細胞壽命維持更長時間，同時也可活化Th細胞，誘導Ts細胞的功能。胸腺五肽的抗感染力和治療作用與它增進TC細胞活性相關。在抗感染免疫中適量胸腺五肽可明顯增加干擾素的產生。誘導和促進T細胞分化成熟；調節T淋巴細胞亞群比例使CD4/CD8趨於正常；增強巨噬細胞吞噬功能；增強紅細胞免疫功能；提高自然殺傷細胞的活力；提高白介素-2的產生水平與受體表達水平；增強外周血單核細胞γ干擾素的產生；增強血清中SOD活性。可用於惡性腫瘤病人經放化療後，免疫功能損傷者；B型肝炎的治療；重大外科手術及嚴重感染；自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎，紅斑狼瘡；Ⅱ型糖尿病、更年期綜合徵；年老體衰免疫功能低下者。

截至2013年6月，胸腺五肽的製備方法成本較高，特別是胺基酸和溶劑的利用率較低，尤其是液相法合成中溶劑使用量大，規模化生產對場地和人員的要求較高，難以實現工業化大生產。

發明內容

專利目的

《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》提供一種醋酸胸腺五肽規模化製備方法。該製備方法利用多批次固相合成，設計了合適套用規模，能夠利用收集密閉保存的反應多餘胺基酸，胺基酸利用率達到67.8%以上。

技術方案

《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》提供了一種醋酸胸腺五肽的規模化製備方法，包括如下步驟：

步驟1：獲得Tyr-樹脂；

步驟2：以胺基酸為第一原料，取Tyr-樹脂經第一逐步偶聯，逐步偶聯Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Boc-Arg（Pbf）-OH，進行第一批次固相合成，獲得第一肽片段-樹脂，分別收集逐步偶聯的反應液作為第一反應液，備用；

步驟3：以第一反應液為第二原料，取Tyr-樹脂經第二逐步偶聯，逐步偶聯Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Boc-Arg（Pbf）-OH，進行第二批次固相合成，獲得第二肽片段-樹脂樹脂，分別收集第二逐步偶聯的反應液作為第二反應液，備用；

步驟4：取所述第二反應液並補充胺基酸作為第三原料，取Tyr-樹脂經第三逐步偶聯，逐步偶聯Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Boc-Arg（Pbf）-OH，進行第三批次固相合成，獲得第三肽片段-樹脂；

步驟5：合併第一肽片段-樹脂、第二肽片段-樹脂和第三肽片段-樹脂，裂解，純化、成鹽即得；第一批次固相合成、第二批次固相合成與第三批次固相合成的物質的量的比為1:0.5～0.8:0.3～0.5。

作為優選，該發明提供的醋酸胸腺五肽的規模化製備方法中，步驟4中補充胺基酸的物質的量與第三批次固相合成的物質的量的比為1:1。

作為優選，該發明提供的醋酸胸腺五肽的規模化製備方法中，步驟1中第一原料的物質的量與第一批次固相合成的物質的量的比為2～5:1。

作為優選，該發明提供的醋酸胸腺五肽的規模化製備方法中，步驟1中偶聯劑為HOBt和DIC。

作為優選，該發明提供的醋酸胸腺五肽的規模化製備方法中，步驟4中偶聯劑為HOBt和DIC。

作為優選，該發明提供的醋酸胸腺五肽的規模化製備方法中，步驟5中裂解所用裂解試劑為TFA與H₂O的混合物，其中TFA與H₂O的體積比為95:5。

作為優選，該發明提供的醋酸胸腺五肽的規模化製備方法中，步驟5中純化採用RP-HPLC方法進行純化。

《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》採用如下步驟：獲得Tyr-樹脂；以胺基酸為第一原料，取Tyr-樹脂經第一逐步偶聯進行第一批次固相合成，獲得第一肽片段-樹脂，分別收集第一逐步偶聯的反應液作為第一反應液，備用；以第一反應液為第二原料，取Tyr-樹脂經第二逐步偶聯進行第二批次固相合成，獲得第二肽片段-樹脂樹脂，分別收集第二逐步偶聯的反應液作為第二反應液，備用；取第二反應液並補充胺基酸作為第三原料，取Tyr-樹脂經第三逐步偶聯進行第三批次固相合成，獲得第三肽片段-樹脂；合併第一肽片段-樹脂、第二肽片段-樹脂和第三肽片段-樹脂，裂解，純化，轉鹽即得；第一批次固相合成、第二批次固相合成與第三批次固相合成的物質的量的比為1:0.5～0.8:0.3～0.5。

改善效果

《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》的條件比較溫和，胺基酸可以重複套用，胺基酸利用率達到67.8%以上，較常規合成方法胺基酸利用率20～50%具有顯著差異，顯著提高了胺基酸利用率，達到節省成本的目的。

附圖說明

圖1示實施例6製備的胸腺五肽粗肽的HPLC譜圖；

圖1

圖2示實施例6製備的胸腺五肽精肽的HPLC譜圖。

圖2

技術領域

《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》涉及多肽製備領域，特別涉及醋酸胸腺五肽規模化製備方法。

權利要求

1.一種胸腺五肽規模化的製備方法，包括如下步驟：

步驟1：獲得Tyr-樹脂；

步驟2：以胺基酸為第一原料，取所述Tyr-樹脂經第一逐步偶聯，逐步偶聯Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Boc-Arg（Pbf）-OH，進行第一批次固相合成，獲得第一肽片段-樹脂，分別收集所述第一逐步偶聯的反應液作為第一反應液，備用；

步驟3：以所述第一反應液為第二原料，取所述Tyr-樹脂經第二逐步偶聯，逐步偶聯Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Boc-Arg（Pbf）-OH，進行第二批次固相合成，獲得第二肽片段-樹脂樹脂，分別收集所述第二逐步偶聯的反應液作為第二反應液，備用；

步驟4：取所述第二反應液並補充胺基酸作為第三原料，取所述Tyr-樹脂經第三逐步偶聯，逐步偶聯Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、BocArg（Pbf）-OH，進行第三批次固相合成，獲得第三肽片段-樹脂；所述補充胺基酸為FmocVal-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Boc-Arg（Pbf）-OH；

步驟5：合併所述第一肽片段-樹脂、所述第二肽片段-樹脂和所述第三肽片段-樹脂，裂解，純化即得；所述第一批次固相合成的肽片段-樹脂、所述第二批次固相合成的肽片段-樹脂與所述第三批次固相合成的肽片段-樹脂的量的比為1:0.5～0.8:0.3～0.5。

實施方式

《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》所用原料及試劑均可由市場購得。

實施例1：Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂的合成

稱取王樹脂25克，替代度為1.20毫摩爾/克,加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。稱取Fmoc-Tyr（tBu）-OH27.6克，HOBt8.9克，加入80毫升DMF，冰水浴下加入10.3毫升DIC，活化3分鐘，加入到反應柱中，在加入0.7克DMAP，室溫反應2小時，抽掉反應液，DMF洗滌樹脂3次，加入預配好的含有70毫升醋酸酐和60毫升吡啶封閉液封閉2小時，抽調封閉液，DMF洗滌6次，甲醇收縮，抽乾得到Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂26.8克，測得替代度為1.08毫摩爾/克。

實施例2：Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂的合成

稱取王樹脂50克，替代度為0.6毫摩爾/克,加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。稱取Fmoc-Tyr（tBu）-OH27.6克，HOBt8.9克，加入80毫升DMF，冰水浴下加入10.3毫升DIC，活化3分鐘，加入到反應柱中，在加入0.7克DMAP，室溫反應2小時，抽掉反應液，DMF洗滌樹脂3次，加入預配好的含有70毫升醋酸酐和60毫升吡啶封閉液封閉2小時，抽調封閉液，DMF洗滌6次，甲醇收縮，抽乾得到Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂51.7克，測得替代度為0.52毫摩爾/克。

實施例3：第一批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂92.6克（100毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取101.8克Fmoc-Val-OH（300毫摩爾）和44.6克HOBt（330毫摩爾）用600毫升DMF溶解，冰水浴下加入51.3毫升DIC（330毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Val-OH反應液，備用。

稱取123.6克Fmoc-Asp（OtBu）-OH（300毫摩爾）和44.6克HOBt（330毫摩爾）用600毫升DMF溶解，冰水浴下加入51.3毫升DIC（330毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，備用。

稱取140.6克Fmoc-Lys（Boc）-OH（300毫摩爾）和44.6克HOBt（330毫摩爾）用600毫升DMF溶解，冰水浴下加入51.3毫升DIC（330毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，備用。

稱取158克Boc-Arg（Pbf）-OH（300毫摩爾）和44.6克HOBt（330毫摩爾）用600毫升DMF溶解，冰水浴下加入51.3毫升DIC（330毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第一肽片段-樹脂178.2克，樹脂增重率為95.8%。偶聯反應後，收集Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，備用。

實施例4：第二批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂55.6克（60毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液120毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

將實施例3得到的Fmoc-Val-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Val-OH反應液，備用。

將實施例3得到的Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，備用。

將實施例3得到的Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，備用。

將實施例3得到的Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第二肽片段-樹脂102.3克，增重率為91.7%。偶聯反應後，收集Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，備用。

實施例5：第三批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂46.3克（50毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液120毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取17.1克Fmoc-Val-OH（50毫摩爾）和7.43克HOBt（55毫摩爾），加入實施例4得到的Fmoc-Val-OH反應液，補加DIC8.5毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取21.3克Fmoc-Asp（OtBu）-OH（50毫摩爾）和7.43克HOBt（55毫摩爾），加入實施例4得到的Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，補加DIC8.5毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取23.4克Fmoc-Lys（Boc）-OH（50毫摩爾）和7.43克HOBt（55毫摩爾），加入實施例4得到的Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，補加DIC8.5毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取26.3克Boc-Arg（Pbf）-OH（50毫摩爾）和7.43克HOBt（55毫摩爾），加入實施例4得到的Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，補加DIC8.5毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第三肽片段-樹脂86.5克，增重率為93.1%。

實施例6：醋酸胸腺五肽的製備

將實施例3第一批次固相合成的第一肽片段-樹脂、實施例4第二批次固相合成的第二肽片段-樹脂、實施例5第三批次固相合成的第三肽片段-樹脂合併得到367克加入到5L圓底燒瓶中，加入預配好的裂解液（TFA：H₂O=95：5）3670毫升，室溫反應2.5小時，濾掉樹脂，樹脂用200毫升TFA洗滌，濾液合併，加入到4L冰乙醚中析出白色沉澱，離心，乙醚洗滌固體，真空乾燥，得到胸腺五肽粗肽143.6克，粗肽收率103.7%，HPLC純度96.2%，如圖1所示。

所得粗肽經過HPLC純化，轉鹽，凍乾，得到醋酸胸腺五肽79.2克，總收率57.2%，如圖2所示。

實施例7：第一批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂92.6克（100毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取169.7克Fmoc-Val-OH（500毫摩爾）和74.3克HOBt（550毫摩爾）用600毫升DMF溶解，冰水浴下加入85.6毫升DIC（550毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Val-OH反應液，備用。

稱取206.3克Fmoc-Asp（OtBu）-OH（500毫摩爾）和74.3克HOBt（550毫摩爾）用600毫升DMF溶解，冰水浴下加入85.6毫升DIC（550毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，備用。

稱取234.5克Fmoc-Lys（Boc）-OH（500毫摩爾）和74.3克HOBt（550毫摩爾）用700毫升DMF溶解，冰水浴下加入85.6毫升DIC（550毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，備用。

稱取312.9克Boc-Arg（Pbf）-OH（500毫摩爾）和74.3克HOBt（550毫摩爾）用900毫升DMF溶解，冰水浴下加入85.6毫升DIC（550毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第一肽片段-樹脂182.3克，樹脂增重率為98.0%。偶聯反應後，收集Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，備用。

實施例8：第二批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂74.1克（80毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

將實施例7得到的Fmoc-Val-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Val-OH反應液，備用。將實施例8得到的Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，備用。

將實施例7得到的Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，備用。

將實施例7得到的Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第二肽片段-樹脂142.2克，增重率為96.3%。偶聯反應後，收集Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，備用。

實施例9：第三批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂46.3克（50毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取17.1克Fmoc-Val-OH（30毫摩爾）和7.43克HOBt（55毫摩爾），加入實施例8得到的Fmoc-Val-OH反應液，補加DIC8.5毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取21.3克Fmoc-Asp（OtBu）-OH（50毫摩爾）和7.43克HOBt（55毫摩爾），加入實施例8得到的Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，補加DIC8.5毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取23.4克Fmoc-Lys（Boc）-OH（50毫摩爾）和7.43克HOBt（55毫摩爾），加入實施例8得到的Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，補加DIC8.5毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取26.3克Boc-Arg（Pbf）-OH（50毫摩爾）和7.43克HOBt（55毫摩爾），加入實施例8得到的Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，補加DIC8.5毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第三肽片段-樹脂86.5克，增重率為93.1%。

實施例10：醋酸胸腺五肽的製備

將實施例7第一批次固相合成的第一肽片段-樹脂、實施例8第二批次固相合成的第二肽片段-樹脂、實施例9第三批次固相合成的第三肽片段-樹脂合併得到411克加入到5L圓底燒瓶中，加入預配好的裂解液（TFA:H₂O=95:5）4110毫升，室溫反應2.5小時，濾掉樹脂，樹脂用200毫升TFA洗滌，濾液合併，加入到4L冰乙醚中析出白色沉澱，離心，乙醚洗滌固體，真空乾燥，得到胸腺五肽粗肽164.7克，粗肽收率105.3%，HPLC純度96.1%。

所得粗肽經過HPLC純化，轉鹽，凍乾，得到醋酸胸腺五肽90.1克，總收率57.6%。

實施例11：第一批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂92.6克（100毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取67.9克Fmoc-Val-OH（200毫摩爾）和29.7克HOBt（220毫摩爾）用300毫升DMF溶解，冰水浴下加入34.2毫升DIC（220毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Val-OH反應液，備用。

稱取82.5克Fmoc-Asp（OtBu）-OH（200毫摩爾）和29.7克HOBt（220毫摩爾）用300毫升DMF溶解，冰水浴下加入34.2毫升DIC（220毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，備用。

稱取93.8克Fmoc-Lys（Boc）-OH（200毫摩爾）和29.7克HOBt（220毫摩爾）用300毫升DMF溶解，冰水浴下加入34.2毫升DIC（550毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液200毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，備用。

稱取125克Boc-Arg（Pbf）-OH（200毫摩爾）和29.7克HOBt（550毫摩爾）用600毫升DMF溶解，冰水浴下加入34.2毫升DIC（550毫摩爾）活化3分鐘後，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽掉反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第一肽片段-樹脂176.5克，樹脂增重率為94.7%。偶聯反應後，收集Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，備用。

實施例12：第二批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂46.3克（50毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

將實施例11得到的Fmoc-Val-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Val-OH反應液，備用。

將實施例11得到的Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，備用。

將實施例11得到的Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。偶聯反應後，收集Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，備用。

將實施例11得到的Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，冰水浴3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第二肽片段-樹脂88.6克，增重率為95.3%。偶聯反應後，收集Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，備用。

實施例13：第三批次固相合成

稱取替代度為1.08毫摩爾/克Fmoc-Tyr（tBu）-王樹脂37.0克（40毫摩爾），加入到反應柱中。加入DMF，溶脹30分鐘。抽乾。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液80毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取13.6克Fmoc-Val-OH（40毫摩爾）和5.94克HOBt（44毫摩爾），加入實施例12得到的Fmoc-Val-OH反應液，補加DIC6.84毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取16.5克Fmoc-Asp（OtBu）-OH（40毫摩爾）和5.94克HOBt（44毫摩爾），加入實施例12得到的Fmoc-Asp（OtBu）-OH反應液，補加DIC6.84毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取18.8克Fmoc-Lys（Boc）-OH（30毫摩爾）和5.94克HOBt（44毫摩爾），加入實施例12得到的Fmoc-Lys（Boc）-OH反應液，補加DIC6.84毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次。加入20%哌啶/DMF（V:V）溶液100毫升，脫保護5和10分鐘，反應結束後，用DMF洗滌樹脂6次，採用茚三酮檢測樹脂有顏色。

稱取25克Boc-Arg（Pbf）-OH（30毫摩爾）和5.94克HOBt（44毫摩爾），加入實施例12得到的Boc-Arg（Pbf）-OH反應液，補加DIC6.84毫升，冰水浴活化3分鐘，加入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時後，反應終點採用茚三酮檢測來判斷（如果樹脂無色透明，則反應完全；如果樹脂顯色則繼續反應1小時。下同），反應結束後，抽調反應液，密封備用；樹脂用DMF洗滌樹脂3次，二氯甲烷洗滌3次，甲醇收縮，抽乾，得到第三肽片段-樹脂69.3克，增重率為93.1%。

實施例14：醋酸胸腺五肽的製備

將實施例11第一批次固相合成的第一肽片段-樹脂、實施例12第二批次固相合成的第二肽片段-樹脂、實施例13第三批次固相合成的第三肽片段-樹脂合併得到334.4克加入到5L圓底燒瓶中，加入預配好的裂解液（TFA：H₂O=95：5）3340毫升，室溫反應2.5小時，濾掉樹脂，樹脂用200毫升TFA洗滌，濾液合併，加入到4L冰乙醚中析出白色沉澱，離心，乙醚洗滌固體，真空乾燥，得到胸腺五肽粗肽130.6克，粗肽收率101.2%，HPLC純度96.1%。

所得粗肽經過HPLC純化，轉鹽，凍乾，得到醋酸胸腺五肽73.4克，總收率56.9%。

榮譽表彰

2016年12月7日，《醋酸胸腺五肽規模化製備方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。