酸性重組蛋白藥物的純化方法:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖

《酸性重組蛋白藥物的純化方法》是浙江海正藥業股份有限公司於2012年9月29日申請的專利，該專利的公布號為CN102911250A，申請公布日為2013年2月6日，發明人是高棟、王海彬、徐傑、聶磊、鄧獻存、白驊。該發明屬於蛋白質分離技術領域。

《酸性重組蛋白藥物的純化方法》以平均等電點（pI）小於7的酸性蛋白為目的蛋白，選用兼有陰離子交換作用以及疏水相互作用的混合模式層析，得到純化的目的蛋白。該發明提供了一種新的純化思路，有效地精細純化酸性蛋白藥物，縮短了工藝流程，提高了產率，降低了生產成本。

2017年12月11日，《酸性重組蛋白藥物的純化方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。

基本介紹

中文名：酸性重組蛋白藥物的純化方法
申請人：浙江海正藥業股份有限公司
申請日：2012年9月29日
申請號：2012103760568
公布號：CN102911250A
公布日：2013年2月6日
發明人：高棟、王海彬、徐傑、聶磊、鄧獻存、白驊
地址：浙江省台州市椒江區外沙路46號
分類號：C07K1/20(2006.01)I、C07K1/18(2006.01)I
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

二十世紀90年代以來蛋白質藥物發展迅速，2012年前有近百種重組蛋白藥物上市，幾千種處於研髮狀態。重組蛋白藥物也稱rDNA藥物，重組蛋白藥物雖然僅占全球處方藥市場的7-8%左右，但是發展非常迅速，二十一世紀其發展更是進入黃金時節，2005年全球銷售額即達到410億美元，2009年僅美國市場蛋白質藥物銷售額已經達到了480億美元，這其中抗體類藥物占了約33%的份額。

重組蛋白質藥物通常採用大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞等表達系統進行表達，其中動物細胞大規模培養生產蛋白質藥物已成為當今生物製藥領域的主流。臨床許多蛋白藥物，特別是治療用藥，需用較高劑量或長期用藥，市場需求量較大，因此該類生物製藥的大規模生產對工藝質量要求較高，必須符合美國FDA標準。抗體類或者Fc融合蛋白類藥物通常採用一步ProteinA親和層析即可達到90%以上純度，其他污染性雜質如脫落的ProteinA、宿主細胞蛋白（HCP）、聚集體（D/A）以及DNA等主要通過離子交換等層析方法去除。其他重組蛋白藥物的HCP、聚集體及DNA等雜質則往往需要更多的純化步驟進行去除。

ProteinA親和層析在反覆使用過程中會產生一定程度的脫落，殘留在產品中的ProteinA會引起不良免疫應答反應，其和抗體的複合物在體內可激活攜帶Fc的白細胞和補體系統的免疫應答，產生氧化和過敏反應，一般採用離子交換層析可以去除（CN101120017A）。美國FDA建議產品中ProteinA殘留應低於10-12ppm。宿主細胞蛋白（HCP）是宿主細胞的蛋白成分，為異源蛋白，殘留在產品中會引起機體的過敏反應，有研究顯示，100ppm的HCP能夠引起患者的免疫反應。

另外，聚集體在發酵、純化以及製劑過程中因一些物理的和化學的因素而經常產生，比如培養的溫度和時間、低pH值、剪下力以及表面吸附等。聚集體不但會使病人產生免疫反應，甚至會使人對藥物產生免疫耐受性，從而大大降低了藥物的藥效。此外，聚集體還會影響蛋白質藥物的生物活性、穩定性以及保存期等。聚集體的去除主要通過層析過程來實現，層析技術比如離子交換層析和疏水層析（USPatent2010/0069617A1），如果聚集體含量高於10%時，單步IEC或HIC的去除能力非常有限，往往需要多個層析步驟才能有效降低聚集體，這樣會使蛋白收率降低，成本增加。Gagnon等人提出採用羥基磷灰石層析技術來去除聚集體（USPatent2010/0145029A1；USPatent2005/0107594A1），該方法去除聚集體的能力很高，可以將60%的聚集體去除到0.1%以下，但是，羥基磷灰石介質的使用壽命短，大規模裝柱困難，且對緩衝液條件要求嚴格，因此並不適合在大規模生產中使用。

混合模式層析是近年發展的新型生物分離方法，不同於單一模式的離子交換層析或疏水相互作用層析，混合模式層析涉及疏水作用力、靜電作用力以及氫鍵作用力等，多種作用力的協同作用可以促進蛋白質的吸附、分離以及洗脫。對於該技術，2012年前中國國內外研究大都集中在其耐鹽吸附特性，包括吸附載量、色譜行為以及蛋白質吸附的分子模擬等，目的是從高電導發酵液中直接捕獲目標分子，並獲得高的回收率。

經對2012年9月之前的技術文獻的檢索發現，Gagnon在《Current Pharmaceutical Biotechnology》上發表的關於混合模式層析技術去除聚集體等雜質的論文《IgG aggregate removal by charged-hydrophobic mixed mode chromatography》，該論文僅僅局限於對鹼性抗體蛋白聚集體的去除。專利（CN101318991A）提到使用混合模式層析技術去除聚集體、HCP及ProteinA殘留等雜質，但也明確指出蛋白等電點≥6.5。酸性蛋白藥物在重組蛋白藥物中占有相當大的比例，2012年前酸性蛋白的純化方法如陰離子交換層析，通常採用吸附-洗脫模式進行純化，處理量有限，且去除HCP等雜質尤其是聚集體的能力也有限，因此，對於酸性蛋白藥物，如何進行高效的精細純化，並適用於大規模生產，是實現酸性蛋白藥物高質量低成本的一個關鍵問題，為此，開發一種酸性蛋白藥物的純化方法具有重要的現實意義。

發明內容

專利目的

該發明的目的在於克服2012年9月之前技術的不足，提供一種酸性重組蛋白藥物的純化方法，使其能夠快速、簡便、低成本、大批量有效的純化製備酸性蛋白藥物。

技術方案

《酸性重組蛋白藥物的純化方法》以平均等電點（pI）小於7的酸性蛋白為目的蛋白，所述蛋白藥物預先經粗提純處理，用提供陰離子交換作用及疏水相互作用的混合模式層析來進一步精細純化，該層析過程包括：調節樣品及平衡緩衝液pH值高於目的蛋白的平均pI1-3個pH單位，然後以過載方式進行上樣，待目的蛋白吸附飽和繼而開始流穿後，收集流穿液，得到純化的目的蛋白，整個層析過程中雜質主要被吸附在層析柱上。

可選地，之後通過0.1M檸檬酸溶液將結合在柱上的聚集體及其他雜質洗脫，最後通過1MNaOH溶液來清洗層析柱。該文中平均pI的定義為：重組蛋白在翻譯後修飾過程中，如糖基化過程，可以引入帶電荷部分，在通過等電聚焦（IEF）測定時會出現多個條帶，即較寬的pI範圍，該發明所述的平均pI即為該pI寬範圍的一個平均值。

所述的技術方案屬於精細純化（polishingpurification）方法，意指一種方法，通過該方法至少一種不希望得到的成分，如聚集體、HCP、ProteinA殘留等雜質，相對於希望得到的目的蛋白減少了，其中所述的經粗提純的蛋白藥物僅含有少量的雜質，如聚集體，還通常含有微量雜質，如HCP等；所述粗純化包括常規的親和層析或疏水作用層析，而經ProteinA親和層析得到的蛋白藥物還會含有微量的ProteinA殘留雜質。

進一步，所述蛋白藥物由微生物或哺乳動物細胞細胞表達，如重組人血清白蛋白rHSA或TNFR-Fc融合蛋白，優選大腸桿菌或酵母菌表達的rHSA，或優選CHO細胞表達、經包括ProteinA親和層析的粗純化製得的TNFR-Fc融合蛋白。

當蛋白藥物為酵母菌表達的重組人血清白蛋白rHSA時，上樣前調節樣品及平衡緩衝液的離子強度至1-5毫秒/厘米：進一步，所述平衡緩衝液為20-70毫摩爾每升、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩衝液A，上樣前用樣品緩衝液將樣品進行緩衝液交換，所述樣品緩衝液為20-70毫摩爾每升、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩衝液。進一步，所述層析的上樣量為300~550毫克/毫升介質。

當蛋白藥物為TNFR-Fc融合蛋白時，上樣前可調節樣品及平衡緩衝液的離子強度至18-30毫秒/厘米：進一步，所述平衡緩衝液為20-50毫摩爾每升、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩衝液B，緩衝液B包含200-350毫摩爾每升NaCl；上樣前用樣品緩衝液將樣品進行緩衝液交換，所述樣品緩衝液包含200-350毫摩爾每升NaCl，為20-50毫摩爾每升、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩衝液。進一步，所述層析的上樣量為150~280毫克/毫升介質。

進一步，所用混合模式層析介質兼有正電荷基團和疏水基團，同時提供陰離子交換作用和疏水相互作用，可為以瓊脂糖為基質的強陰離子交換、強疏水作用的介質，如CaptoAdhere；也可為以纖維素為基質的弱陰離子交換、強疏水作用的介質，如PPAHyperCel，或弱陰離子交換、弱疏水作用的介質HEAHyperCel。進一步，所述層析的流速為90-120厘米/小時。

該發明使用兼有陰離子交換作用及疏水相互作用的介質，在一定離子強度下，利用聚集體疏水性質強於單體的特點，使聚集體與單體目的蛋白分離；緩衝液pH值高於目的蛋白等電點的條件，使樣品與介質表面存在靜電吸引作用力，以去除聚集體、HCP及ProteinA等雜質；另外，所述的操作方式不同於常規層析操作，是以過載方式進行操作，儘管開始上樣時，由於目的蛋白與介質表面存在靜電吸引作用力，目的蛋白也會吸附在層析介質上，但目的蛋白與雜質在層析柱上吸附飽和的載量不同，目的蛋白濃度遠大於雜質而在層析柱上最先吸附飽和，目的蛋白吸附飽和後繼續上樣會大量流穿，樣品中的微量雜質則不斷被吸附至層析柱上，所以，收集整個流穿液即得到精細純化的目的蛋白。

改善效果

《酸性重組蛋白藥物的純化方法》提供了一種新的純化思路，以過載方式進行上樣，能夠有效的純化酸性重組蛋白，去除產品中的聚集體、HCP及ProteinA等污染性雜質，可提高終產物的質量，使其純度達99%以上；該發明能一步有效的精細純化酸性蛋白藥物，縮短了工藝流程，提高了產率，降低了生產成本，同時具有穩定性好、過程控制指標明確、適合規模化生產等特點。

附圖說明

圖1為重組人血清白蛋白rHSA的發酵液經過初步分離（實施例1），rHSA樣品的SEC-HPLC色譜圖，橫坐標為蛋白質出峰時間，其中聚集體蛋白於15.9分鐘出峰，目的蛋白於17.8分鐘出峰，縱坐標為mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白與聚集體蛋白的峰面積比為97.4%:2.6%。

圖2為重組人血清白蛋白rHSA的發酵液經過初步分離及緩衝液交換後上樣CaptoAdhere混合模式層析柱的色譜圖（實施例2），其中縱坐標mAU表示A280紫外吸收值，橫坐標為單位體積介質的上樣量，樣品經過吸附飽和區後開始流穿，流穿峰為目的蛋白，清洗峰為聚集體等雜質成分。

圖3為實施例2中採用CaptoAdhere純化得到的rHSA樣品的SEC-HPLC色譜圖，橫坐標為蛋白質出峰時間，目的蛋白於17.8分鐘出峰，縱坐標為mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白與聚集體蛋白的峰面積比為99.6%:0.4%。

圖4為重組人血清白蛋白rHSA的發酵液經過初步分離及緩衝液交換後上樣PPAHyperCel混合模式層析柱的色譜圖（實施例3），其中縱坐標mAU表示A280紫外吸收值，橫坐標為單位體積介質的上樣量，樣品經過吸附飽和區後開始流穿，流穿峰為目的蛋白，清洗峰為聚集體等雜質成分。

圖5為實施例3中採用PPAHyperCel純化得到的rHSA樣品的SEC-HPLC色譜圖，橫坐標為蛋白質出峰時間，目的蛋白於17.8分鐘出峰，縱坐標為mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白與聚集體蛋白的峰面積比為99.2%:0.8%。

圖6為實施例5中親和層析洗脫的TNFR-Fc融合蛋白樣品的SEC-HPLC色譜圖，橫坐標為蛋白質出峰時間，其中聚集體蛋白於13.8分鐘出峰，目的蛋白於15.9分鐘出峰，縱坐標為mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白與聚集體蛋白的峰面積比為95.9%:4.1%。

圖7為TNFR-Fc融合蛋白的發酵液經過親和層析及緩衝液交換後上樣CaptoAdhere混合模式層析柱的色譜圖（實施例6），其中縱坐標mAU表示A280紫外吸收值，橫坐標為單位體積介質的上樣量，樣品經過吸附飽和區後開始流穿，流穿峰為目的蛋白，清洗峰為聚集體等雜質成分。

圖8為實施例6中採用CaptoAdhere純化TNFR-Fc融合蛋白後樣品的SEC-HPLC色譜圖，橫坐標為蛋白質出峰時間，其中目的蛋白於15.9分鐘出峰，縱坐標為mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白與聚集體蛋白的峰面積比為99.5%:0.5%。

圖9為TNFR-Fc融合蛋白的發酵液經過親和層析及緩衝液交換後上樣PPAHyperCel混合模式層析色譜圖（實施例7）；其中縱坐標mAU表示A280紫外吸收值，橫坐標為單位體積介質的上樣量，樣品經過吸附飽和區後開始流穿，流穿峰為目的蛋白，清洗峰為聚集體等雜質成分。

圖10為實施例7中採用PPAHyperCel純化TNFR-Fc融合蛋白聚集體後樣品的SEC-HPLC色譜圖，橫坐標為蛋白質出峰時間，其中目的蛋白於15.9分鐘出峰，縱坐標為mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白與聚集體蛋白的峰面積比為98.2%:1.8%。

圖11為實施例8中採用HEAHyperCel純化TNFR-Fc融合蛋白聚集體後樣品的SEC-HPLC色譜圖，橫坐標為蛋白質出峰時間，其中目的蛋白於15.9分鐘出峰，縱坐標為mAU表示A280紫外吸收值，目的蛋白與聚集體蛋白的峰面積比為99.1%:0.9%。

權利要求

1.一種酸性重組蛋白藥物的純化方法，以平均等電點pI小於7的酸性蛋白為目的蛋白，所述蛋白藥物預先經粗提純處理，其特徵在於，用提供離子交換作用及疏水相互作用的混合模式層析來進一步精細純化，該析過程包括：調節樣品及平衡緩衝液pH值高於目的蛋白的平均pI1-3個pH單位，然後以過載方式進行上樣，待目的蛋白吸附飽和繼而開始流穿後，收集流穿液，得到純化的目的蛋白，整個層析過程中雜質主要被吸附在層析柱上。

2.如權利要求1所述的純化方法，其特徵在於，所述蛋白藥物由微生物細胞表達或哺乳動物細胞，如重組人血清白蛋白rHSA或TNFR-Fc融合蛋白，優選大腸桿菌或酵母菌表達的rHSA，或優選CHO細胞表達、經包括ProteinA親和層析的粗純化製得的TNFR-Fc融合蛋白。

3.如權利要求2所述的純化方法，其特徵在於，所述蛋白藥物為酵母菌表達的重組人血清白蛋白rHSA，上樣前調節樣品及平衡緩衝液的離子強度至1-5毫秒/厘米。

4.如權利要求3所述的純化方法，其特徵在於，所述平衡緩衝液為20-70毫摩爾每升、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩衝液A，上樣前用樣品緩衝液將樣品進行緩衝液交換，所述樣品緩衝液為20-70毫摩爾每升、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩衝液。

5.如權利要求4所述的純化方法，其特徵在於，所述層析的上樣量為300~550毫克/毫升介質。

6.如權利要求2所述的純化方法，其特徵在於，所述蛋白藥物為TNFR-Fc融合蛋白，上樣前調節樣品及平衡緩衝液的離子強度至18-30毫秒/厘米。

7.如權利要求6所述的純化方法，其特徵在於，所述平衡緩衝液為20-50毫摩爾每升、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩衝液B，緩衝液B包含200-350毫摩爾每升NaCl；上樣前用樣品緩衝液將樣品進行緩衝液交換，所述樣品緩衝液包含200-350毫摩爾每升NaCl，為20-50毫摩爾每升、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩衝液。

8.如權利要求7所述的純化方法，其特徵在於，所述層析的上樣量為150~280毫克/毫升介質。

9.如權利要求1-8任一項所述的純化方法，其特徵在於，所述的混合模式介質為以瓊脂糖為基質的介質，如CaptoAdhere，或為以纖維素為基質的介質，如PPAHyperCel或HEAHyperCel。

10.如權利要求9所述的純化方法，其特徵在於，所述層析的流速為90-120厘米/小時。

實施方式

實施例1

待純化樣品重組人血清白蛋白（rHSA）的製備：重組人血清白蛋白rHSA等電點約為4.9，通過酵母細胞培養表達，通過離心和深層過濾進行發酵液的澄清後，進行68C加熱（含10毫摩爾每升辛酸鈉，pH6.0，30分鐘）處理以滅活在酵母發酵過程中產生的蛋白酶，樣品冷卻到室溫後調節pH至4.5、電導處於4毫秒/厘米後，通過SPSepharoseFF進行純化，平衡緩衝液為50毫摩爾每升乙酸鈉，pH4.5，洗脫緩衝液為50毫摩爾每升乙酸鈉，0.6M氯化鈉，pH6.5。再將洗脫液直接上柱PhenylSepharoseFF，平衡緩衝液為50毫摩爾每升乙酸鈉，0.5M氯化鈉，pH6.0，洗脫緩衝液為20毫摩爾每升乙酸鈉，pH6.0。所得粗提純蛋白的SEC-HPLC液相圖譜如附圖1所示。

實施例2

混合模式層析介質CaptoAdhere純化rHSA：配置磷酸鹽緩衝液A₁：70毫摩爾每升PBS，pH6.5，通過裝有G25凝膠過濾介質的層析柱將實施例1的樣品，即待純化樣品進行緩衝液交換。利用AKTAexplorer100層析系統，將1毫升CaptoAdhere混合模式介質裝填於Tricorn5/50層析柱中，用8倍柱體積的磷酸鹽緩衝液A₁充分平衡層析柱後，開始上樣，上樣量控制為550毫克/毫升介質，流速為100厘米/小時。當樣品上完後，繼續用平衡緩衝液沖洗至基線，收集整個流穿峰，經過液相色譜檢測（SEC-HPLC色譜圖如附圖3所示），即為目的蛋白。之後通過0.1M檸檬酸溶液進行洗脫，洗脫液即為結合在柱上的聚集體及其他雜質，最後通過1MNaOH溶液來清洗層析柱。整個過程的色譜圖如附圖2所示。

實施例3

混合模式層析介質PPAHyperCel純化rHSA：配置磷酸鹽緩衝液A₂：20毫摩爾每升PBS，pH7.5，通過裝有G25凝膠過濾介質的層析柱將實施例1的樣品，即待純化樣品進行緩衝液交換。利用AKTAexplorer100層析系統，將1毫升PPAHyperCel混合模式介質裝填於Tricorn5/50層析柱中，用8倍柱體積的磷酸鹽緩衝液A₂充分平衡層析柱後，開始上樣，上樣量控制為380毫克/毫升介質，流速為100厘米/小時。當樣品上完後，繼續用平衡緩衝液沖洗至基線，收集整個流穿峰，經過液相色譜檢測（SEC-HPLC如附圖5所示），即為目的蛋白。之後通過0.1M檸檬酸溶液進行洗脫，洗脫液即為結合在柱上的聚集體及其他雜質，最後通過1MNaOH溶液來清洗層析柱。整個過程的色譜圖如附圖4所示。

實施例4

rHSA純化後雜質含量的測定：實施例2、3純化後所得rHSA的聚集體含量通過液相色譜柱TSKgelG3000SWXL（30×7.8）來分析檢測，使用系統為AgilentHPLC系統。流動相為50毫摩爾每升PB，300毫摩爾每升NaCl，pH7.0，檢測波長為280納米。充分平衡液相柱至基線穩定後，進樣，進樣體積為50微升，流速為0.5毫升/分鐘。HCP含量採用標準Elisa方法測定。實施例2、3純化後所得樣品的測定結果如表1所示。

實施例5

待純化樣品重組腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白（TNFR-Fc融合蛋白）的製備：TNFR-Fc融合蛋白的平均等電點約為4.8，通過中國倉鼠卵巢細胞（CHO）培養表達，採用離心和深層過濾進行發酵液的澄清處理。利用AKTAexplorer100層析系統，將80毫升MabSelectSuRe親和介質裝填於XK26/20層析柱中，用5倍柱體積的平衡緩衝液（20毫摩爾每升Tris，150毫摩爾每升NaCl，pH7.4）充分平衡層析柱後，以150厘米/小時的線速度和25毫克/毫升的動態載量開始上含有TNFR-Fc融合蛋白的澄清料液，上樣結束後，繼續用上述平衡緩衝液沖洗，待280納米紫外吸收回到基線後，用5倍體積的高鹽緩衝液（20毫摩爾每升Tris，1.0MNaCl，pH7.4）清洗，然後用3倍體積的平衡緩衝液洗滌，最後用洗脫緩衝液（50毫摩爾每升檸檬酸鹽緩衝液，pH3.5）洗脫TNFR-Fc融合蛋白，並收集洗脫液。蛋白樣品的SEC-HPLC色譜如附圖6所示，橫坐標為蛋白質出峰時間，其中聚集體蛋白於13.8分鐘出峰，目的蛋白於15.9分鐘出峰。將洗脫液保持在pH3.6下、2小時做病毒滅活，接著用pH8.0的2MTris緩衝液中和至pH7.0，以防止蛋白的酸不穩定降解。

實施例6

混合模式層析介質CaptoAdhere純化TNFR-Fc融合蛋白：配置磷酸鹽緩衝液B₁：50毫摩爾每升PBS，350毫摩爾每升NaCl，pH7.5，通過裝有G25凝膠過濾介質的層析柱將實施例5的洗脫液，即待純化樣品進行緩衝液交換。利用AKTAexplorer100層析系統，將1毫升CaptoAdhere混合模式介質裝填於Tricorn5/50層析柱中，用8倍柱體積的磷酸鹽緩衝液B₁充分平衡層析柱後，開始上樣，上樣量控制為280毫克/毫升介質，流速為100厘米/小時。當樣品上完後，繼續用平衡緩衝液沖洗至基線，收集整個流穿峰，經過液相色譜檢測（SEC-HPLC如附圖8所示），即為目的蛋白。之後通過0.1M檸檬酸溶液進行洗脫，洗脫液即為結合在柱上的聚集體及其他雜質，最後通過1MNaOH溶液來清洗層析柱。整個過程的色譜圖如附圖7所示。

實施例7

混合模式層析介質PPAHyperCel純化TNFR-Fc融合蛋白：配置磷酸鹽緩衝液B₂：20毫摩爾每升PBS，200毫摩爾每升NaCl，pH6.5，通過裝有G25凝膠過濾介質的層析柱將實施例5的洗脫液，即待純化樣品進行緩衝液交換。利用AKTAexplorer100層析系統，將1毫升PPAHyperCel混合模式介質裝填於Tricorn5/50層析柱中，用8倍柱體積的磷酸鹽緩衝液B₂充分平衡層析柱後，開始上樣，上樣量控制為200毫克/毫升介質，流速為100厘米/小時。當樣品上完後，繼續用平衡緩衝液沖洗至基線，收集整個流穿峰，經過液相色譜檢測（SEC-HPLC如附圖10所示），即為目的蛋白。之後通過0.1M檸檬酸溶液進行洗脫，洗脫液即為結合在柱上的聚集體及其他雜質，最後通過1MNaOH溶液來清洗層析柱。整個過程的色譜圖如附圖9所示。

實施例8

混合模式層析介質HEAHyperCel純化TNFR-Fc融合蛋白：配置磷酸鹽緩衝液B₃：50毫摩爾每升PBS，300毫摩爾每升NaCl，pH6.5，通過裝有G25凝膠過濾介質的層析柱將實施例5的洗脫液，即待純化樣品進行緩衝液交換。利用AKTAexplorer100層析系統，將1毫升HEAHyperCel混合模式介質裝填於Tricorn5/50層析柱中，用8倍柱體積的磷酸鹽緩衝液B₃充分平衡層析柱後，開始上樣，上樣量控制為150毫克/毫升介質，流速為100厘米/小時。當樣品上完後，繼續用平衡緩衝液沖洗至基線，收集整個流穿峰，經過液相色譜檢測（SEC-HPLC如附圖11所示），即為目的蛋白。之後通過0.1M檸檬酸溶液進行洗脫，洗脫液即為結合在柱上的聚集體及其他雜質，最後通過1MNaOH溶液來清洗層析柱。

實施例9

TNFR-Fc融合蛋白純化後雜質含量的測定：實施例5-8純化後所得的TNFR-Fc融合蛋白的聚集體含量通過液相色譜柱TSKgelG3000SWXL（30×7.8）來分析檢測，使用系統為AgilentHPLC系統。流動相為50毫摩爾每升PB，200毫摩爾每升NaCl，pH7.0，檢測波長為280納米。充分平衡液相柱至基線穩定後，進樣，進樣體積為50微升，流速為0.5毫升/分鐘。HCP含量及ProteinA含量採用標準Elisa方法測定。實施例5-8所得樣品的測定結果如表2所示。

表1混合模式層析法以過載方式純化rHSA結果

介質	回收率（%）	SEC-HPLC純度（%）	HCP含量（ppm）
粗分離樣品	—	97.4%	15.4
Capto Adhere	96%	99.6%	1.2
PPA HyperCel	94%	99.2%	0.9

表2混合模式層析法以過載方式純化TNFR-Fc融合蛋白結果

介質	回收率（%）	SEC-HPLC純度（%）	HCP含量（ppm）	ProteinA含量（ppm）
粗分離樣品	/	95.9%	4X6.1	8.11
Capto Adhere	92%	99.5%	29.2	0.61
PPA HyperCel	85%	98.2%	41.3	0.28
HEA HyperCel	90%	99.1%	38.5	0.17

表1、2結果表明，利用混合模式層析技術，採用過載方式，能夠有效的純化酸性蛋白藥物，降低產品的聚集體、HCP及ProteinA殘留等污染性雜質，提高終產物的質量，純度可達99%以上，回收率90%以上；該發明能一步有效的純化酸性重組蛋白藥物，縮短了工藝流程，提高產率，降低生產成本，同時具有穩定性好、過程控制指標明確、適合規模化生產等特點。

榮譽表彰