《分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法》是廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心於2000年1月7日申請的發明專利，該專利的申請號為001140108，公布號為CN1303948，公布日為2001年7月18日，發明人是李校坤、劉澤寰、吳曉萍、付小兵、馮成利。
《分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法》涉及生產酸性成纖維細胞生長因子的方法，特別是涉及利用分子伴侶與人酸性成纖維細胞生長因子在原核生物體內的共表達，以生產可溶性酸性成纖維細胞生長因子蛋白的方法。
2014年11月6日，《分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法
- 公布號：CN1303948
- 公布日：2001年7月18日
- 申請號：001140108
- 申請日：2000年1月7日
- 申請人：廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心
- 地址：廣東省廣州市天河區石牌暨南大學
- 發明人：李校坤、劉澤寰、吳曉萍、付小兵、馮成利
- 分類號：C12N15/70、C12N15/12、C07K14/50、A61K38/18
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
成纖維細胞生長因子（FGF）是由至少9種結構上相關的蛋白質（FGF1-9）組成的生長因子家族，其中了解最清楚的是酸性成纖維細胞生長因子（aFGF或稱FGF-1）和鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF或稱FGF-2）。已知FGF家族的成員均為中胚層和神經外胚層來源的各種類似細胞的有絲分裂原，並且這些因子還具有促進血管生成、神經軸突延伸、神經元再生和存活、骨或軟骨組織修復及成肌細胞分化等多種生物學功能。一般說來，FGF家庭各成員之間的核心序列存在有大約25-55％的胺基酸序列同源性，因此FGF家族可能具有共同的始祖基因。
aFGF和bFGF可與同一受體結合，但也不能排除兩者各有其特異受體的可能。最近，有人發現每個aFGF分子可與兩個受體分子結合。還發現不同組織中存在有不同分子量的aFGF和bFGF，推測這種情況可能是由於這些分子在不同細胞內經受不同的轉錄後加工過程所導致的。
一般說來，aFGF，和bFGF的共有化學特徵是這些因子可與肝素緊密結合，但其中aFGF對肝素的親和性要比bFGF小，同時aFGF的等電點更偏酸性（pH5-7）。已知肝素可通過幾種方式調節FGF分子的功能（Loss,Eur.J.Clin.Invest.,18:321-326,1988），例如肝素或肝素樣分子可直接作用於FGF，激活或增強aFGF和bFGF的活性（Uhlrich et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,137:1205-1213,1986）。另外，發現可溶性肝素的增效作用似乎對aFGF有選擇性，而且其強化aFGF活性的程度及比bFGF大10倍。肝素樣物質也是FGF特別是aFGF的優選穩定劑。
FGF的獨特的血管生成活性和細胞增殖活性使之特別適用於促進組織傷口特別是深部傷口的癒合。例如美國專利4，378，347和歐洲專利0505811分別述及天然bFGF可用於治療早老性痴呆和帕金森氏病等神經退化性疾病（Wallicke et al.,PNAS,USA83:3012-3016,1986）。國際專利WO93/08828和歐洲專利0741143分別公開了使用aFGF活性片段保護中樞神經元並改善腦功能的方法。國際專利申請96/38167描述了以aFGF為基本活性成分的用於促進骨組織修復和/或生長的藥物組合物。
就生物學活性而言，雖然aFGF比bFGF低得多，但業已發現，aFGF在待治療的損傷部位，特別是在大部分的處於酸性環境的損傷部位（如淺表組織損傷和胃潰瘍），aFGF比bFGF更易於發揮其溫合而持久的生物學活性，從而更有利於這些條件下的臨床套用。
許多技術文獻報導了以重組DNA技術生產aFGF的方法（例如參見Biotechnology5:960,1987;J.Biol.Chem.263:16471,1988;EP0219052等）。截至2000年1月，為了進一步改善aFGF的生物學活性、提高產物的表達效率及增加表達產物的穩定性，一些實驗室已構建了許多改良的重組表達系統（如參見WO96/08572、WO98/32869、EP406738等）。另一方面，一些專利申請還公開了具有提高的生物學活性和/或穩定性的aFGF類似物或突變體（如意見WO96/22369、WO92/11366、WO91/11459）。但也有人證明，整合形式的全長度aFGF的活性要比去除了N末瑞部分氨基的其他形式aFGF的活性大約高3倍（參見EPO505811）。
截至2000年1月，主要是使用細菌特別是大腸桿菌作為以重組技術工業規模生產蛋白質的宿主細胞，大腸桿菌的主要優點是：易於遺傳操作並能保持轉化株的穩定性；經大體積培養可獲得高產率的表達產物；以及細胞易於培養，從而可降低生產成本。然而，使用大腸桿菌生產生物學活性蛋白質特別是真核細胞蛋白的一個重要缺點是，表達產物在宿主胞漿內形成所謂“包涵體”，即無生物學活性的不溶性聚合體。形成包涵體的優點是可保護被表達的蛋白質免於遭受宿主細胞中蛋白酶的降解，並能夠用離心方法很容易地將包涵體分離出來。但為了得到有生物學活性的蛋白質產物，必須對包涵體進行變性一溶解一變性處理。這個過程一般要在反覆試驗的基礎上完成，而且常常不能獲得令人滿足的產物回收率。為了解決這一難題，人們試圖採用分子伴侶技術，使目的基因與具有協助蛋白質跨膜運輸、參予維持蛋白質高級結構及調節細胞的生長與分化等功能的分子伴侶基因共表達，以期在細胞所固有的分泌信號肽幫助下，實現前體分子的跨膜分泌和正確切割，並維持成熟的分泌蛋白的正確構象。
2000年1月前現已知道，大腸桿菌中存在有某些與菌體蛋白質的分泌密切相關的分泌因子，如Sec家族。這些因子與信號肽酶及其他一些已知和未知的因子相互作用，參予細胞內蛋白質的跨膜轉運和加工。作為Sec家族的一個重要成員，SecB是以四聚體形式存在於胞漿內的由155個胺基酸組成的可溶性分子伴侶蛋白（Kumatomo.C.A.et al.，Mol.Microbiol.5:19-22，1991）。SecB可與核糖體上合成的大多數分泌型蛋白或多肽結合，以維持其適於跨膜運輸的活性構象。當分泌型前體蛋白或多肽的肽鏈發生折迭時，SecB通過分子骨架的β片層結構與之發生相互作用（BreukinkE.et al.，Eur.J.Biochem.208:414-425，1992）。當前體蛋白或多肽被運送到內膜中之後，SecB即與具有ATP酶結構特徵的另一個Sec家族成員SecA結合，並在SecA及其他相關因子的幫助下完成分子的跨膜分泌。
發明內容
專利目的
《分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法》的一個目的是提供在大腸桿菌中分泌表達aFGF的重組表達載體，其中所說的表達載體包含與第一啟動子可操作地連線的編碼分子伴侶的核苷酸序列，而且所說的序列下游連線有一個與第二啟動子可操作地連線的編碼全長度酸性成纖維細胞生長因子的核苷酸序列。
該發明的另一個目的是提供一種在原核宿主中以可溶形式分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法。
技術方案
根據《分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法》的表達載體，其中所說的分子伴侶是大腸桿菌SecB。
根據該發明的表達載體，其中所說的第一和第二啟動子選自IacZ啟動子、大腸桿菌鹼性磷酸酯酶啟動子和噬菌體T7啟動子，並且第一和第二啟動子是相同或不同的。
根據該發明的表達載體，其中所說的編碼aFGF的核苷酸序列是從天然來源中篩選的野生序列、經人工誘變或修飾得到的突變序列或化學合成的序列。
該發明的另一個目所述的方法包括以下步驟：
（1）提供編碼人酸性成纖維細胞生長因子的核苷酸序列；
（2）將步驟（1）的核苷酸序列連線到編碼大腸桿菌分子伴侶的核苷酸序列上，並將所得序列連線到適當的表達載體中；
（3）用步驟（2）的重組表達載體轉化適當的原核宿主細胞；
（4）在適於以可溶的分泌形式表達人酸性成纖維細胞生長因子的條件下培養步驟（3）的被轉化的大腸桿菌宿主細胞；
（5）除去培養物中的不溶性部分，並從可溶性部分中回收所需的具有人酸性成纖維細胞生長因子活性的多肽。
根據該發明的方法，其中的說的重組表達載體包括可操作地連線到編碼人酸性成纖維細胞生長因子的核苷酸序列上的第一啟動子序列，和位於其上游的可操作地連線到編碼分子伴侶的核苷酸序列上的第二啟動子序列。
根據該發明的方法，其中所說的第一和第二啟動子是lacZ啟動子、大腸桿菌鹼性磷酸酯酶啟動子或噬菌體T7啟動子。
根據該發明的方法，其中所說的分子伴侶蛋白是大腸桿菌SecB。
附圖說明
圖1顯示SecB的胺基酸序列（上方）和其核苷酸編碼序列（下方）。
圖2顯示用於在大腸桿菌中共表達分泌信號SecB和人aFGF的重組表達載體的構建。
技術領域
《分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法》涉及生產酸性成纖維細胞生長因子的方法，特別是涉及利用分子伴侶與人酸性成纖維細胞生長因子在原核生物體內的共表達，以生產可溶性酸性成纖維細胞生長因子蛋白的方法。
權利要求
在大腸桿菌中分泌表達的酸性成纖維細胞生長因子重組表達載體，其中所述的表達載體包括處於1acZ啟動子控制下的SecB基因序列，所述的SecB基因序列下游連線有一個處於T7啟動子控制下的編碼全長酸性成纖維細胞生長因子的核苷酸序列。
實施方式
操作內容
該發明涉及以重組DNA技術生產aFGF的方法，特別是涉及以原核生物體作為宿主，以可溶性分泌形式生產人aFGF（haFGF）的方法。更具體他說，該發明涉及用於在大腸桿菌中以可溶性分泌蛋白的形式表達人aFGF的重組表達，被所說的重組表達載體轉化的重組體細胞，以及按該發明方法生產的haFGF多肽。該發明進一步涉及按該發明的方法製備的haFGF在治療由於血管病變、心肌梗塞或腦出血引起的局部缺血性疾病、促進組織修復及傷口癒合中的套用。
該發明用於分泌表達aFGF的重組表達載體包括一個表達分子伴侶蛋白的第一轉錄單位和用於表達aFGF的第二轉錄單位，其中所說的第一轉錄單位和第二轉錄單位可以彼此串聯連線於同一個重組載體內，但也可以分別存在於共轉化同一原核宿主細胞的兩個不同的重組載體內。
就兩轉錄單位彼此間的串聯連線方式而言，該發明的重組表達載體首先包括一個可操作地連線到第一啟動子上的編碼分子伴侶的核苷酸序列，和一個可操入第二轉錄單位的插入位點。藉助這個插入位點，可以很容易地在所說的表達載體中插入基本上由編碼aFGF的核苷酸序列和其上游的第二啟動子組成的第二轉錄單位。另外，在第二轉錄單位的第二啟動子與編碼aFGF多肽的DNA序列之間力有一個額外的信號肽序列，並在如此得到的融合基因的下游加入一個轉錄終止子序列。
得到編碼人aFGF基因的優選方法是人工合成方法，因為這樣可使翻譯的蛋白質最佳化，而且易於對基因序列進行人工誘變。可以基於得自人體或其他動物組織的aFGF的胺基酸序列來合成基因。例如可以基於Gimenes-Gallego等人（Science 230:1385-1388,1985）所述的牛胺基酸序列或基於Gimenes-Gallego等人（Biochem，Biophys，Res.Comm.138:611-617,1986）所述的人胺基酸序列合成牛或人aFGF基因。可按照Itatura等人（Science 198:1056-1063,1977）所述的技術合成編碼aFGF的核苷酸序列。或者，也可以按照Aviv和Leder（Proc.Natl Acad.Sci.USA69:1408-1412,1972）所述的方法，從表達aFGF的細胞，例如人腦垂體、乳腺癌、腦、腦幹或下丘腦細胞中提取含poly（A）的RNA，以得到編碼haFGF的cDNA。亦可使用HuynhV.T.等人（DNA Cloning Techniques:APractical Approach，IRL Press,Oxford,1984）的λgt10載體，從這些組織的mRNA得到cDNA文庫，並利用所得到的雜交克隆回收編碼aFGF的完整序列。
一般說來，為了提高基因的表達效率和產物的產率，應適當地選擇更適合於特定編碼序列的啟動子、宿主和載體的最佳組合。在使用大腸桿菌宿主表達aFGF的情況下，最好使用強的T7啟動子表達aFGFcDNA。另外，考慮到宿主細胞內能量的有限性，我們優選相對較弱（所需能量較少）的lacZ啟動子驅動大腸桿菌分子伴侶基因的表達。
作為與編碼aFGF的核苷酸序列共表達的分子伴侶基因，該發明優選編碼具有分泌功能的分子伴侶SecB蛋白的核苷酸序列。SecB是大腸桿菌分泌因子Sec家族中唯一存在於胞質內的可溶性蛋白質，而SecA、SecD、SecE、SecF及SecY等其他分泌因子則均定位於細胞膜上。SecB可與大多數蛋白或多肽結合，使之維持其特異的鬆散摺疊，處於有益於分子轉運的空間構象。SecB將與之結合的蛋白質運送到細胞膜上後，進一步與SecA結合，並在其他分泌因子的協同下完成目的蛋白或多肽的運輸。由於SecB結合位點不需要有特定的胺基酸序列，而只要帶有單正電荷並具有β摺疊區域即可，所以其可與大多數蛋白質或多肽結合。然而，由於受細菌細胞固有的SecB蛋白含量等因素的限制，已在核糖上大量合成的外源蛋白質常常積聚在細胞內，發生前體分子的無規摺疊和分子聚集，使這些前體分子不能與各種相關分子伴侶（特別是SecB）蛋白結合，從而喪失其跨膜運輸能力。為了克服這一缺陷，我們試圖將SecB基因串聯到編碼aFGF之核苷酸的上游或下游區，以期實現aFGF的分泌表達。或者，亦可使兩者分別攜帶於兩個不同的載體上，並用所得到的兩個重組載體轉化同一大腸桿菌宿主，達到兩者同步表達並分泌表達aFGF的目的。
應特別指出的是，為了實現aFGF的分泌表達並提高其表達水平，須在haFGF編碼序列的上游和啟動子（T7啟動子）下游之間插入一個分泌信號序列。該序列在5’→3’方向上包括翻譯起始密碼子（ATG），然後是Shina-Dalgarno序列，最後是終止密碼子（TAA）。優選的信號序列是ATG TAGT CGA TTA AAT AAG GAG GAA（參見Schoner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8506-8510,1986）。為了方便起見，可在以PCR擴增方法製備合成的aFGF時，在擴增引物中加入這樣的序列。
可使用任何一種適於在大腸桿菌宿主中穩定地保留並複製的載體，經遺傳操作構建該發明的重組表達載體。可選用的起始質粒包括pBR322、pUC18、pUC119、pSP64、pGEM-3、pTE-3和pT7-7。該發明優選的是帶有T7啟動子的多拷貝質粒pT7-7。
可使用任何一種適於在其中以高效率共表達所需蛋白質（aFGF和secB）的大腸桿菌株作為宿主，這樣的菌株包括大腸桿菌MM294、DH-1、C600、DE-3和BL21等。該發明優選的宿主是大腸桿菌菌株BL21。
可按照該領域已知的技術進行基因的分離和合成、克隆和表達載體的構建、DNA序列分析及鑑定、宿主細胞轉化和培養，以及表達產物的分離和純化等操作（參見Sambrook et al.，Molecular Cloning:ALaboratory Mannual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cola Spring Harbor,NY,1989）。
為該發明的目的，可以首先將以大腸桿菌YU537的染色體DNA為模板，經PCK擴增得到的SecB導入帶有lacE啟動子（第一啟動子）的質粒pUC18中。或者，也可以將預先製備的，包括lacZ啟動子和SecB基因第一轉錄單位直接連線到該發明選用的表達載體pT7-7中T7啟動子的（第二啟動子）的上游，得到重組質粒pT7-SecB。為了有效地表達基本上沒有宿主內源性DNA序列的編碼SecB的基因，必要時可在分子伴侶基因的下游連線一個終止信號，或在設計並克隆分子伴侶基因時加入這樣的終止子序列。可以適當地調整第一啟動子序列與分子伴侶基因之間的距離，以獲得最佳轉錄效率。
然後，使用基於aFGFcDNA的核苷酸序列合成的寡核苷酸引物，並以按上述方法製得的aFGFcDNA作為模板，經PCR擴增得到正鏈未端帶有NdeⅠ位點的合成的雙股aFGF基因序列。用SmaⅠ+NdeⅠ雙酶切按前述方法製得的質粒pT7-SecB後，將所得到的aFGF編碼序列連線到SmaⅠ-NdeⅠ大片段上，進而得到以串聯方式連線的，含有處於lacZ啟動子驅動下的SecB基因和處於T7啟動子驅動下的aFGF基因的重組載體（pUCSec-T7-aFGF）。
可以按常規方法（如CaCl2處理法）用攜帶上述第一和第二轉錄單位的重組質粒轉化適當的大腸桿菌菌株（如參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2110,1972），並按該領域技術人員熟知的方法，例如使用LB培養基發酵培養經篩選得到的轉化株。
發酵完成後，可以用簡單的離心法分離培養物上清，並用已知的三步驟層析法（陽離子交換層析-肝素-Sepharose親和柱-反向高效液相層析（HPLC）（參見美國專利5，312，911）將aFGF純化到銀染色的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳呈單一帶的基本上純的均質狀態。可用胺基酸組成分析法和氨基末端序列檢測法鑑定haFGF蛋白的結構真實性，並進一步使用Thomas等人（J.Biol.Chem.225:5517-5520,1980）的成纖維細胞（Babl/c3T3A31細胞系）有絲分裂法估測純化的rhaFGF的生物學活性。
可以將按該發明方法製備的rhaFGF與選自人血清白蛋白、多聚甘氨酸、金屬陽離子（如Zn、Mn和Mg）及低分子量肽的活性蛋白質保護劑，選自聚乙二醇、羧甲基纖維素鹼金屬鹽、肝素、硫酸肝素或其類似物、硫酸多糖、谷胱甘肽的穩定劑混合，並加入該領域技術人員熟知的藥物載體或賦形劑，製成適於經胃腸道途徑，特別是經胃腸道外途徑給藥的物組合物。可以按照製藥領域的常規方法，將這樣的藥物組合物製成適於經血管內、肌肉內、或腹腔內給藥的溶液劑、徑口服給藥的片劑或粉末劑，或製成適合於外用的栓劑、軟膏、霜劑、乳化劑等劑型。
該發明的藥物組合物可用於促進因燒傷或其他機械創傷造成的軟組織、肌腱、韌帶、軟骨或骨組織傷口的修復或癒合。所說的軟組織包括皮膚、肌肉、血管、內臟器官及角膜組織等除骨和軟骨組織外的所有組織。一般說來，aFGF的局部或皮下用藥量約為1-100微克/平方厘米/天。當用於促進骨骼肌和軟骨損傷修復時，最好是在外科手術或創傷的損傷部位投用該發明的藥物組合物。用於促進骨骼肌癒合的給藥劑量約為10-100微克/立方厘米/天。該發明的藥物組合物亦可用於治療血管組織損傷，如促進血管生長（血管生成）和血管修復（促進受損部位的血管內皮細胞增殖）。可在損傷部位內用藥，以發揮其體內血管生成活性，用藥量約為10-100微克/平方厘米/天。該發明的藥物組合物還可用於促進中樞和外周神經組織修復，包括刺激阿爾海默氏病（早老性痴呆）病理過程中受損的海馬神經元的生長。作為該發明藥物組合物的活性成分，aFGF可刺激因各種原因受到損傷的神經組織，使之通過成神經細胞的有絲分裂再生新的神經元，恢復受損部位的神經細胞群體，並促進軸突的延伸。
儘管已知aFGF的生物學活性明顯低於鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF），但大量的實驗研究證明，aFGF比bFGF作用相對更為溫和，特別是aFGF更適合於大多數傷口的低pH環境。因此，可將該發明藥物組合物製成適於口服給藥的製劑，用於治療胃或十二指腸潰瘍，或者製成適當的外用製劑，用於創傷（包括手術創傷，特別是局部呈酸性pH環境的深部創傷）的治療。我們的研究結果（數據未示出）表明，當與其他用於創傷（如皮膚切割傷或胃潰瘍）修復的生長因子，特別是表皮生長因子聯合使用時，aFGF似乎比bFGF有更好的治療效果。aFGF能夠使創傷部位的成纖維細胞和表皮細胞保持更好的再生比較，獲得更好的生理修復效果。
實施案例
實施例1：SecB基因的製備
為了製備用於《分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法》的大腸桿菌分泌因子SecB基因，首先將大腸桿菌菌株YK537（由日本東京大學MAKARTYAMASAK1提供）培養在含有氨苄青黴素（100微克/毫升）的LB培養基（每升含蛋白腖10g，酸母提取物5g和氯化鈉10g）中，細胞增殖後按常規方法分離染色體DNA。
以YK537細胞的染色體總DNA為模板，並使用合成的寡核苷酸引物（1）:5’-GGAATTCGATGTCAGAACAAAACAACAC-3’（SEQ ID NO：1）和引物（2）：3’-AACTGCAGTTATCAGGCATCCTGATGTTC-5’（SEQ ID NO：2），在Taq聚合酶存在下進行PCR反應（90°變性30秒，50℃退火60秒，72℃聚合60秒），共反應30較循環後，72℃延伸10分鐘，以擴增得到兩末端分別帶有EcoRⅠ（GAATTC）和Pstl（CTGCAG）酶切位點的長度約480bp的片段。電泳（1％低熔點膠）分離PCR反應混合物，染色後從凝膠上切下相當於480bp的電泳條帶並回收之。
然後用EcoRⅠ+Pstl酶消化帶有lacZ啟動子（作為第一啟動子）的質粒pUC18，回收大片段後在T4DNA連線酶存在下，將上述480bp片段連線到該大片段上，環化後得到攜帶SecB基因的重組質粒pUC-SecB。用所得質粒轉化感受態大腸桿菌DH5細胞（Bethesda Research Labs）。培養增殖後從轉化株克隆中分離單鏈EcoRⅠ-PstT片段。按已知方法並使用通用引物測定正向和反向連線片段的DNA序列，結果顯示所得到的片段為編碼155個胺基酸的SecB蛋白的核苷酸序列，從而得到所需的SecB基因片段。
實施例2：攜帶SecB基因的重組質粒pT7-SecB的構建
為了利用T7啟動子作為表達aFGF蛋白的第二啟動子，我們首先將實施例1中製備的SecB基因連線到表達載體中。為此，首先用BglⅡ消化質粒PT7-7（Dept.Of Biol.Chem.，Harvard Medical School,Boston,Mass.02115），分離質粒大段並用S1核酸酶將其末端修成平端。在T4DNA連線酶存在下，將其與已用S1核酸酶處理的上述SecB基因（PvuⅡ-PstⅠ）連線在一起，環化後得到攜帶SecB基因的中間質粒pT7-SecB。
實施例3：分泌表達aFGF蛋白的重組載體的構建
為了構建包括以串聯方式連線有處於lacZ啟動子控制下的SecB基因，和處於T7啟動子控制下並在上游包括一個分泌信號序列的aFGF基因的重組表達載體，首先以aFGFcDNA文庫作為模板，並使用基於aFGF的胺基酸序列化學合成的寡核苷酸引物（3）:5’-TGTATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATTCAATCTGCCAC-3’（SEQ ID NO：3）（其中下劃粗黑線的部分為分泌信號序列，下劃細黑線的部分為NdeⅠ酶切位點），和引物（4）:3’-TTAGTCAGAGCTCAC-5’（SEQ ID NO：4），以常規PCR反應（92℃變性30秒，50℃退火45秒，70℃聚合60秒，經35次循環後72（延伸10分鐘）擴增得到5’端帶有分泌信號，並且3’端帶有一個NdeⅠ酶切位點的編碼aFGF的核苷酸片段。
用NdeⅠ酶切實施例2中製得的質粒PT7-SecB，並用T4DNA連線酶將編碼aFGF的核苷酸序列連同其5’端分泌信號序列連線到pT7-SecB中SecB基因序列的下游，從而得到該發明的重組表達質粒pUCSec-T7-aFGF。
實施例4：aFGF蛋白的分泌表達與純化
按照常規CaCl2處理法用實施例3的重組載體轉化感受態大腸桿菌BL21菌株（Stratagene）。在含有1％蛋白腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、0.4％葡萄糖和約50微克/毫升青黴素的LB培養基中37℃培養轉化細胞。當細胞培養物的560納米光密度約達到0.6時，加入IPTG至終濃度為1毫摩爾/升，並繼續培養18小時。培養完成後，離心收集培養物上清，並依次使用陽離子交換樹脂、肝素-Sepharose複合物和反向高效液相層柯法（HPLC）純化aFGF蛋白質。
為此，首先將經過透析的培養物上清液懸浮於約0.1摩爾/升磷酸鹽緩衝液（pH6.0）中，並加入已用同樣緩衝液平衡過的陽離子交換劑CM-Sephadex（6毫升/克蛋白質）。4℃靜止2小時後，將樹脂收集到玻璃柱內並用磷酸鹽緩衝鹽水（pH6.2）洗柱3次。洗柱後用含有0.5摩爾/升NaCl的磷酸鹽緩衝鹽水洗脫蛋白質。然後向洗脫物中加入用10毫摩爾/升磷酸鹽緩衝液（pH7.0）平衡過的肝素-Sopharose（1毫升/克蛋白質）。4℃輕輕振動並放置約1小時後，收集樹脂-蛋白質複合物並填柱。用含有0.6摩爾/升NaCl的20毫摩爾/升磷酸鹽緩衝液洗柱後，用含有1.0摩爾/升NaCl的同樣緩衝液洗脫所需的蛋白質.最後收集洗脫物（監測280納米吸光率）並加於已用5毫摩爾/升三氟乙酸（TFA）平衡的C4反相HPLC柱（5毫米×25厘米）上，用TFA（0-100％）+CH3CN（0-60％）梯度洗脫，收集單一主蛋白質峰值部分後得到高純度（約98％）的aFGF蛋白質。
純化的產物蛋白質經還原後用聚丙烯醯胺凝膠（15％分離膠）電脈分離，銀染色後顯示出分子量約16.1KD的單一帶。通過胺基酸組成分析和N末端序列測定進一步證實按該發明方法製備的aFGF的真實性。
實施例5：分泌表達的haFGF的生物學活性
參照Thomas等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:357-361,1984）所述的方法，根據3H-胸腺嘧啶摻入Babl/c小鼠3T3細胞DNA中的量，估測純化的重組aFGF的促有絲分裂活性。簡單地說，在含有10％胎牛血清的培養基中將Babl/c3T3細胞（5×10/孔）培養至單層匯合後，更換培養基並繼續培養24小時。培養後向各孔內加入試驗樣品（10微升），保溫12小時後再加入0.2微克CiH-胸腺嘧啶（New Englamd Nuclear）和0.3微克末標記的胸腺嘧啶（Sigma），繼續保溫12小時。保溫後檢測摻入細胞DNA中的放射活性（cpm）。其中所加樣品為連續的2倍稀釋液，並在本底峰值DNA合成之間跨越至少3個數量級。一個刺激單位定為產生半數最大反應所需的aFGF稀釋液的濃度。將每毫克純aFGF的刺激單位數定為比有絲分裂活性。按該發明的方法製得的aFGF產生最大DNA合成刺激作用所需的濃度約為3.2納克/毫升。
榮譽表彰
2014年11月6日，《分泌表達酸性成纖維細胞生長因子的方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
