《酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒》是寧波美康生物科技有限公司於2008年9月23日申請的發明專利，該專利的申請號為2008101663266，公布號為CN101363042，公布日為2009年2月11日，發明人是鄒炳德、姜雲飛，該專利涉及生物製劑技術領域。
《酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒》成分為：溶血緩衝液：10-1000毫摩爾/升N-環乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000毫摩爾/升嗎啉代丙烷磺酸，1-100克/升聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑R1a：10-1000kU/升豬胃蛋白酶，0.1-10毫摩爾/升2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽，0.0001-0.1毫摩爾/升HCl；試劑R1b：0.1-10毫摩爾/升嗎啉代乙基磺酸，0.5-50毫摩爾/升CaCl2；中和緩衝液：0.0001-0.1毫摩爾/升NaOH，試劑2：1-1000kU/升果糖纈氨酸氧化酶，30-600kU/升過氧化物酶，0.01-0.5毫摩爾/升N-（羧甲基氨羰基）-4,4雙偶（二甲胺）-二苯胺鈉鹽，10-1000毫摩爾/升Tris-HCl。該試劑盒酶解效果好於鹼性蛋白酶，用量少成本低，測量結果精確。
2014年11月6日，《酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒
- 公布號：CN101363042
- 公布日：2009年2月11日
- 申請號：2008101663266
- 申請日：2008年9月23日
- 申請人：寧波美康生物科技有限公司
- 地址：浙江省寧波市鄞州中心區孫馬工業區科技路358號
- 發明人：鄒炳德、姜雲飛
- 分類號：C12Q1/28（2006.01）、C12Q1/26（2006.01）、G01N21/78（2006.01）
- 代理機構：寧波市鄞州甬致專利代理事務所
- 類別：發明專利
- 代理人：代忠炯
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
截至2008年9月，血液中的糖化血紅蛋白（糖化Hb）濃度被用作糖尿病的診斷和治療的重要指標糖化血紅蛋白的測定可採用離子交換層析法、高效液相色譜法、親和層析法、放射免疫法、酶免疫法和膠乳免疫凝集法等。但這些方法或者需要專用儀器、價格昂貴，或者檢測時間長、測量精度差。最近流行的酶法檢測，利用氧化還原反應，不需要特殊的測定儀器，操作簡便易行，精度高，時間短，因此廣泛套用於生化分析和臨床檢查。
糖化血紅蛋白的酶法檢測依照以下方法進行。首先，將含有糖化血紅蛋白的樣品用蛋白水解酶處理，使得糖化蛋白質分解為較小的糖化肽片段和糖化胺基酸；然後，將果糖纈氨酸氧化酶（FVO）作用於該糖化蛋白質的分解物，進行氧化還原反應，釋放出過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶的作用下與顯色基質發生反應，使得顯色基質顯色；通過測定顯色基質的顯色量，可以確定過氧化氫的量，從而可知樣品中糖化蛋白質的量。
以前用於消化糖化血紅蛋白的蛋白水解酶為鹼性蛋白酶，包括金屬蛋白酶、鳳梨蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶及氨基肽酶等，酶解效果有待提高，且酶解反應中，除糖化血紅蛋白以外，其它糖化蛋白質和糖化肽也能被水解，影響了檢測結果的精確度。
發明內容
專利目的
《酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒》的目的在於克服上述不足，提供一種酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，克服了以往試劑盒只能在鹼性條件下酶解的弊端，酶解效果好於鹼性蛋白酶，且用量僅為鹼性蛋白酶的十分之一至五十分之一，成本更低；測量結果精確、符合糖化血紅蛋白臨床檢測要求快速、大批量、經濟的特點，有利於臨床大規模套用。
技術方案
《酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒》是由溶血緩衝液、試劑R1a、試劑R1b、中和緩衝液和試劑2組成的，其中：溶血緩衝液：10-1000毫摩爾/升N-環乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000毫摩爾/升嗎啉代丙烷磺酸，1-100克/升聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑R1a：10-1000kU/升豬胃蛋白酶，0.1-10毫摩爾/升2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽，0.0001-0.1毫摩爾/升HCl；試劑R1b：0.1-10毫摩爾/升嗎啉代乙基磺酸，0.5-50毫摩爾/升CaCl2；中和緩衝液：0.0001-0.1毫摩爾/升NaOH；試劑2：1-1000kU/升果糖纈氨酸氧化酶，30-600kU/升過氧化物酶，0.01-0.5毫摩爾/升N-（羧甲基氨羰基）-4,4雙偶（二甲胺）-二苯胺鈉鹽，10-1000毫摩爾/升Tris-HCl。
該發明試劑盒在糖化血紅蛋白的酶法檢測中套用了豬胃蛋白酶。豬胃蛋白酶是一類酸性蛋白酶，其最適反應pH值為1.5-3.5。當用於血紅蛋白的酶解時，豬胃蛋白酶的酶解效果好於金屬蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等鹼性蛋白酶，且用量僅為鹼性蛋白酶的十分之一至五十分之一。
該發明開發的新型試劑盒初始反應緩衝液為酸性環境，pH值為2.0左右，後經中和緩衝液中和，達到中性環境附近，便於終止蛋白水解反應，進行下一步的氧化還原反應。在初始反應緩衝液中，可用鹽酸或磷酸營造酸性環境，首選鹽酸，其反應速度快且反應完全。中和緩衝液可採用氫氧化鈉中和初始反應緩衝液中過量的鹽酸，使反應環境pH值約為7.0-8.5。此後果糖纈氨酸氧化酶在該偏鹼性環境下（pH7.0-8.5）作用於樣品，產生過氧化氫。過氧化氫在過氧化物酶催化下使顯色基質顯色，通過測定顯色基質的顯色量，最終確定樣品中糖化血紅蛋白的量。
該試劑盒優選採用高活性果糖纈氨酸氧化酶FVO-m-21，其含有SEQID.No.1所示核苷酸序列和SEQID.No.2所示胺基酸序列。其製備方法步驟如下：
（1）以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因編碼序列為模板，進行易錯PCR擴增，建立果糖纈氨酸氧化酶的突變文庫；
（2）將突變文庫轉入大腸桿菌，對其基因進行克隆、重組轉化和表達；
（3）利用醌法測定酶活性，篩選出高活性果糖纈氨酸氧化酶。
棒狀桿菌屬Corynebacteriumsp.2-4-1菌株含有果糖基纈氨酸氧化酶（FVO）的編碼微克基因。該發明基於FVO的基因編碼序列，設計兩條FVO基因的易錯PCR引物，上游引物序列為：5’-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3’，下游引物序列為：5’-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3’。以FVO的基因編碼序列作為模板，進行易錯PCR擴增，經擴增35個循環後，PCR產物純化回收，與原核表達載體pMD-18TVector連線，轉化入大腸桿菌XL1-Red中，塗布LB平板，收集含有插入片段的克隆，組成突變體庫。
提取突變體庫中的質粒DNA，酶切，回收目的片段，連線入載體pGEX-4T-1m，轉化入BL-21菌株，塗布於含有IPTG、果糖纈氨酸和N-（羧甲基氨基羰基）-4,4-二（甲基氨基）-聯苯胺[DA-64]的LB平板，由於大腸桿菌自身含有過氧化物酶，故37℃培養12-24小時後，可見明顯變色現象。挑取變色快和變色圈大的克隆進行液體培養基培養。
將初步篩選出的克隆在25℃液體培養基中培養48小時，誘導表達，裂解細菌，利用醌法測定酶活性，最終得到一株酶活性約為普通果糖纈氨酸氧化酶活性6倍的高活性菌株，其所攜帶的FVO突變命名為FVO-m-21。通過測序分析發現，該突變克隆中發生五個鹼基點突變，分別是鹼基序列中57位C→T、374位T→C、534位G→A、914位C→A和1056位G→C，共引起了兩個胺基酸突變，分別是胺基酸序列中125位Ile→Thr和305位Ala→Glu。
作為進一步優選，該發明試劑盒的組成如下：溶血緩衝液：10-800毫摩爾/升N-環乙基-2氨基乙烷磺酸，10-900毫摩爾/升嗎啉代丙烷磺酸，1-100克/升聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑Rla：10-700kU/升豬胃蛋白酶，0.1-10毫摩爾/升2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽，0.0001-0.1毫摩爾/升HCl；試劑R1b：2-8毫摩爾/升嗎啉代乙基磺酸，0.5-40毫摩爾/升CaCl2；中和緩衝液：0.0001-0.1毫摩爾/升NaOH；試劑2：20-80kU/升FVO-m-21，30-500kU/升過氧化物酶，0.01-0.5毫摩爾/升N-（羧甲基氨羰基）-4,4雙偶（二甲胺）-二苯胺鈉鹽，10-800毫摩爾/升Tris-HCl。
作為最優選，該發明試劑盒的組成如下：溶血緩衝液：600毫摩爾/升N-環乙基-2氨基乙烷磺酸，450毫摩爾/升嗎啉代丙烷磺酸，50克/升聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑R1a：500kU/升豬胃蛋白酶，3毫摩爾/升2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽，0.005毫摩爾/升HCl；試劑R1b：6毫摩爾/升嗎啉代乙基磺酸，20毫摩爾/升CaCl2；中和緩衝液：0.03毫摩爾/升NaOH；試劑2：50kU/升FVO-m-21，250kU/升過氧化物酶，0.1毫摩爾/升N-（羧甲基氨羰基）-4,4雙偶（二甲胺）-二苯胺鈉鹽，600毫摩爾/升Tris-HCl。
改善效果
該發明試劑盒採用酸性豬胃蛋白酶，克服了以往試劑盒只能在鹼性條件下酶解的弊端，酶解效果好於鹼性蛋白酶，且用量僅為鹼性蛋白酶的十分之一至五十分之一，成本更低；檢測血紅蛋白時，除糖化血紅蛋白以外，其它糖化蛋白質和糖化肽都難以被水解，果糖纈氨酸氧化酶也難以作用於上述其它糖化蛋白質等，因此可以只測定糖化血紅蛋白，使得結果更精確。另外，試劑盒中的高活性酶FVO-m-21可更快速地與糖化肽片段或糖化胺基酸反應，生成過氧化氫，在相同底物量的反應體系中，所需的酶量也更少，可降低生產成本，縮短反應時間，便於更快速的進行大批量樣品檢測。
權利要求
1、《酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒》其特徵在於該試劑盒是由溶血緩衝液、試劑R1a、試劑R1b、中和緩衝液和試劑2組成的，其中：溶血緩衝液：10-1000毫摩爾/升N-環乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000毫摩爾/升嗎啉代丙烷磺酸，1-100克/升聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑R1a：10-1000kU/升豬胃蛋白酶，0.1-10毫摩爾/升2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽，0.0001-0.1毫摩爾/升HCl；試劑R1b：0.1-10毫摩爾/升嗎啉代乙基磺酸，0.5-50毫摩爾/升CaCl2；中和緩衝液：0.0001-0.1毫摩爾/升NaOH；試劑2：1-1000kU/升果糖纈氨酸氧化酶，30-600kU/升過氧化物酶，0.01-0.5毫摩爾/升N-（羧甲基氨羰基）-4,4雙偶（二甲胺）-二苯胺鈉鹽，10-1000毫摩爾/升Tris-HCl。所述果糖纈氨酸氧化酶為FVO-m-21，其含有SEQID.No.2所示胺基酸序列。
2、根據權利要求2所述的酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，其特徵在於：溶血緩衝液：10-800毫摩爾/升N-環乙基-2氨基乙烷磺酸，10-900毫摩爾/升嗎啉代丙烷磺酸，1-100克/升聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑R1a：10-700kU/升豬胃蛋白酶，0.1-10毫摩爾/升2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽，0.0001-0.1毫摩爾/升HCl；試劑R1b：2-8毫摩爾/升嗎啉代乙基磺酸，0.5-40毫摩爾/升CaCl2；中和緩衝液：0.0001-0.1毫摩爾/升NaOH；試劑2：20-80kU/升FVO-m-21，30-500kU/升過氧化物酶，0.01-0.5毫摩爾/升N-（羧甲基氨羰基）-4,4雙偶（二甲胺）-二苯胺鈉鹽，10-800毫摩爾/升Tris-HCl。
3、根據權利要求2所述的酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒，其特徵在於：溶血緩衝液：600毫摩爾/升N-環乙基-2氨基乙烷磺酸，450毫摩爾/升嗎啉代丙烷磺酸，50克/升聚氧化乙烯十二烷基醚；試劑R1a：500kU/升豬胃蛋白酶，3毫摩爾/升2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽，0.005毫摩爾/升HCl；試劑R1b：6毫摩爾/升嗎啉代乙基磺酸，20毫摩爾/升CaCl2；中和緩衝液：0.03毫摩爾/升NaOH；試劑2：50kU/升FVO-m-21，250kU/升過氧化物酶，0.1毫摩爾/升N-（羧甲基氨羰基）-4,4雙偶（二甲胺）-二苯胺鈉鹽，600毫摩爾/升Tris-HCl。
實施方式
實施例1
高活力果糖纈氨酸氧化酶FVO-m-21的獲得。
一、以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因編碼序列為模板，進行易錯PCR擴增。
1.引物序列：
正向引物：5’-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3’
反向引物：5’-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3’
2.易錯PCR反應體系和反應條件：
PCR反應體系：100微升體系中含有：10毫摩爾/升Tris-HClpH8.30，50毫摩爾/升KCl，6.5毫摩爾/升MgCl2，0.15毫摩爾/升MnCl2，0.2毫摩爾/升dGTP/dATP，0.8毫摩爾/升dTTP/dCTP，2.2微克SSBProtein，0.5微摩爾/升正向/反向引物，10納克模板DNA，2.5單位TaqDNA聚合酶。
PCR反應條件：94℃5分鐘；94℃30sec，55℃30sec，72℃2分鐘，35個循環；72℃10分鐘；4℃forever。
3.易錯PCR產物取3微升於1％的瓊脂糖凝膠電泳，可見1kb左右有產物條帶。將易錯PCR產物用純化回收試劑盒純化回收，與pMD-18TVector連線，轉化入大腸桿菌XL1-Red中，塗布Amp抗性LB平板，可獲得Corynebacterium sp.2-4-1的FVO基因的突變體庫。
二、突變體菌株的初篩：
提取突變體庫中的質粒DNA，用BamHI和HindIII雙酶切，回收1kb左右的目的片段，載體pGEX-4T-1m同樣用BamHI和HindIII雙酶切，回收，二者4℃連線過夜，轉化入BL-21菌株，塗布於含有IPTG、果糖纈氨酸和N-（羧甲基氨基羰基）-4,4-二（甲基氨基）-聯苯胺[DA-64]的LB平板，37℃培養12-24小時後，可見明顯變色現象。挑取變色快和變色圈大的克隆進行液體培養基培養，共挑取克隆48個。
三、突變體酶活性的醌法檢測：
1.在誘導表達4小時後，收集菌液，測量並且記錄細胞培養物的OD600值。
2.製備檢測酶活的細菌裂解液。在374微升B-PER細菌蛋白抽提試劑（Pierceproduct78248）中重新懸浮細胞，再加入50微升蛋白酶和磷酸化酶抑制劑以及細菌細胞提取物（Sigma產品P8465），1微升34毫克/毫升的氯黴素（用甲醇配製）。快速渦旋振盪一分鐘。在冰上放置5分鐘。離心1分鐘後置於冰上。
3.用Bradford法測定蛋白含量。
4.取50微升上述細菌裂解液加到醌法反應混合液中，37℃溫浴1-3分鐘，測量555納米處吸光值。反應混合液成分為：100毫摩爾/升磷酸鉀緩衝液（pH8.0），1purpurogallinunit/毫升過氧微克化物酶，0.45毫摩爾/升4-氨基安替吡啉，0.5毫摩爾/升TOOS（N-乙基-N-（2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺），5.0毫摩爾/升果糖纈氨酸，總體積為3 。
其中，一個酶活力單位定義為在37℃每分鐘可催化產生0.5微摩爾/升醌染料。實際酶活力按每分鐘每mg蛋白質所形成的納米ol產物來測定。
四、高活性突變FVO的序列測定：
通過酶活力測定，篩選出活力約為普通果糖纈氨酸氧化酶活力6倍的高活突變。提取質粒DNA，測序發現該突變序列如SEQID.No.1所示。其中發生突變的位點，為57位C→T、374位T→C、534位G→A、914位C→A和1056位G→C。
對應的胺基酸序列如SEQID.No.2所示。其中發生突變的胺基酸位點，共有兩個胺基酸突變，分別是胺基酸序列中125位Ile→Thr和305位Ala→Glu。
實施例2
以蒸餾水為溶劑，按照常規配製試劑方法配製，如表1所示。
實施例3
套用該發明試劑盒測定糖基化血紅蛋白標準液。
從患者採集全血（患者數16名），紅細胞自然沉降回收，取20微升沉降的紅細胞部分，向其中加入上述溶血緩衝液500微升。將得到的30微升溶血試樣與40微升試劑R1a和40微升試劑R1b混合，於37℃溫浴3分鐘。加入40微升中和緩衝液，混勻，讀取吸光度A1。再向反應體系中加入20微升試劑2，於37℃溫浴2分鐘，讀取吸光度A2。△A＝A2—A1。測定時可選擇751納米和571納米處的吸光值。其中，Hb濃度可由波長751納米處的吸光度求出，HbAlc濃度可由波長571納米處的吸光度求出。
計算公式：
/ | / | 微克配方1 | 配方2 | 配方3 |
溶血緩衝液 | N-環乙基-2氨基乙烷磺酸 | 900毫摩爾/升 | 10毫摩爾/升 | 600毫摩爾/升 |
嗎啉代丙烷磺酸 | 1000摩爾/升 | 20摩爾/升 | 450毫摩爾/升 | |
聚氧化乙烯十二烷基醚 | 90克/升 | 20克/升 | 50克/升 | |
試劑 R1a | 豬胃蛋白酶 | 900kU/升 | 10kU/升 | 500kU/升 |
2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽 | 10毫摩爾/升 | 0.5毫摩爾/升 | 3毫摩爾/升 | |
HCL | 0.1毫摩爾/升 | 0.0001毫摩爾/升 | 0.005毫摩爾/升 | |
試劑 R1b | 嗎嚇代乙基磺酸 | 9毫摩爾/升 | 0.5毫摩爾/升 | 6毫摩爾/升 |
CaCl2 | 45毫摩爾/升 | 1毫摩爾/升 | 20毫摩爾/升 | |
中和緩衝液 | NaOH | 0.1毫摩爾/升 | 0.0001毫摩爾/升 | 0.03毫摩爾/升 |
試劑2 | 果糖纈氨酸氧化酶FVO | 1000kU/升 | — | — |
高活性果糖纈氨酸氧化酶 FVO-m-21 | —— | 1kU/升 | 50kU/升 | |
過氧化物酶 | 500kU/升 | 50kU/升 | 250kU/升 | |
N-（羧甲基氨羰基）-4,4雙偶（二甲胺）-二苯胺鈉鹽 | 0.5摩爾/升 | 0.02毫摩爾/升 | 0.1毫摩爾/升 | |
Tris-HCl | 800毫摩爾/升 | 10毫摩爾/升 | 600毫摩爾/升 |
實施例4
採用金屬蛋白酶的酶法測定糖化血紅蛋白的試劑盒配方。
與實施例2不同處在於試劑R1a的成分和不套用中和緩衝液。其它處理方法相同。
試劑R1a為：100-10000kU/升金屬蛋白酶，0.1-10毫摩爾/升2-（碘苯基）-3-（2,4-二硝基苯）-5-（2,4-二磺苯基）-2H四唑鈉鹽。
HPLC法（%） | 2.9 | 4.0 | 5.2 | 6.0 | 6.9 | 7.9 | 9.1 | 10.1 | 10.9 | 12.1 | 13.2 |
該發明試劑盒（%） | 3.1 | 4.1 | 5.1 | 5.9 | 7.0 | 8.2 | 9.1 | 10.0 | 10.8 | 12.0 | 13.2 |
金屬蛋白酶試劑盒（%） | 2.8 | 3.8 | 4.9 | 6.1 | 7.3 | 7.9 | 8.9 | 9.8 | 11.2 | 11.7 | 13.4 |
表2表示為該發明酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒與用金屬蛋白酶檢測糖化血紅蛋白的試劑盒測量精度對比表，還包括採用HPLC法測定的標準參考值。以HPLC法測定值為橫坐標，該發明酶法檢測糖化血紅蛋白試劑盒和金屬蛋白酶檢測糖化血紅蛋白的試劑盒測量值為縱坐標，擬合直線，得到實施例的相關式為“y＝0.9955x+2.0727，R＝0.9987；“y＝1.0227x+1.8455，R2＝0.9958”。由此可知該發明試劑盒的測量精度與HPLC法測定的標準參考值幾乎一致，而且比普通金屬蛋白酶的糖化蛋白檢測試劑要高，因此該發明試劑盒可以以優良的精度測定糖化血紅蛋白。
榮譽表彰
2014年11月6日，《酶法檢測糖化血紅蛋白的試劑盒》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
