基本介紹
- 中文名：選擇性沉澱法
- 外文名：Selective precipitation method
選擇性沉澱法的原理,選擇性沉澱法舉例,材料,方法,
選擇性沉澱法的原理
選擇性沉澱法的原理是利用蛋白質對某些物理或化學因素敏感性的不同，而有選擇地使之變性沉澱，達到分離提純的目的。不同蛋白質在不同的條件下有不同的穩定性，改變溫度、pH或加入有機溶劑，許多雜蛋白發生變性沉澱，而目的蛋白不形成沉澱，就可以分離出比較純的目的蛋白。
利用對熱的穩定性不同，加熱破壞某些蛋白，而保留目的蛋白，可以達到除去雜蛋白的目的。比如利用雜蛋白在不同溫度下產生沉澱，將樣品溶液升溫至45～65℃，保溫一定時間，使雜蛋白形成最大程度的沉澱，同時，目的蛋白的活性損失最少。由於不少蛋白酶在此溫度範圍內比較穩定，為了避免樣品中發生酶解而造成目的蛋白的活性損失，操作前可適當加入蛋白酶抑制劑。
利用酸鹼變性有選擇地除去雜蛋白，很多蛋白質在pH 5.0或以下被沉澱，只有少數蛋白質在中性或鹼性條件下形成沉澱。如果目的蛋白在此pH範圍內能夠保持穩定，就可以通過調節pH來除去雜蛋白。這樣的例子很多，比如用2．5%的三氯乙酸處理胰蛋白酶、抑肽酶或細胞色素C粗提液，均可除去大量雜蛋白，而對所提取的酶活性沒有影響。該方法還適用於初步純化原核微生物表達的重組蛋白質，因為很多細菌蛋白質的等電點在pH5.0左右，通過調節pH至其等電點一可以先除去這部分蛋白質。調節pH時，常用醋酸、檸檬酸或碳酸鈉，也可採用高氯酸、三氯醋酸等強酸，但是需要注意安全。加入10%的三氯醋酸可以沉澱大部分的蛋白質，20%的三氯醋酸可以沉澱分子量低予20000的蛋白質，操作時需在冰水浴中進行。
選擇性沉澱法舉例
以鹽析法選擇性沉澱蛋白質為例簡述沉澱步驟。蛋白質鹽析常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等。其中套用最廣的是硫酸銨，其優點是溫度係數小而溶解度大(25℃時飽和溶解度為4.1mol/L，即541g/L；0℃時飽和溶解度為3.9mol/L，即515g/L)，在這一溶解度範圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來，而且硫酸銨價廉易得，分段效果比其他鹽好，不容易引起蛋白質變性。在建立沉澱蛋白質的最初鹽析方案時，硫酸銨是最好的選擇。鹽析就是從沒有顆粒物的含有蛋白質混合物溶液開始，使用分步鹽析的方法將粗混合物分級分離成兩個部分，只有一個部分含有目的蛋白。
材料
適當pH的緩衝液、硫酸銨、澄清的粗蛋白溶液。
方法
1 將蛋白質樣品對緩衝液或緩衝液/硫酸銨混合液透析，硫酸鹽的濃度要低於使蛋白質開始沉澱所需的鹽濃度；
2 進行一個預試驗來確定蛋白質濃度、pH、鹽濃度、溫度和溫育時間，在小試管中放入一系列的小份樣品，在開始的試驗中使用大的步級(如1～2個pH單位，或5～10倍的鹽濃度差異)，在後續的試驗中可以將步級變窄；
3 用量筒測量要濃縮的蛋白質的體積，然後倒入適當容積的燒杯中，燒杯置於冰浴中；
4 在硫酸銨表中，查找產生20%飽和度所需的固體硫酸銨的量，稱量出所需的硫酸銨，研磨成光滑的粉末；
5 在冷室中將裝有預冷的蛋自質溶液的燒杯放在一個攪拌器上，然後緩慢加入固體硫酸銨，讓混合物攪拌60min以確保沉澱完全；
6 將混合物轉移至離心管中，平衡後於4℃，10000g離心15min
7 輕輕倒出上清液，將蛋白質顆粒(占0～20%組分)及上清液(含有仍溶解於20%硫酸銨的蛋白質)保存好；
8 將上清液放回冷室，緩慢地往上清液中加入硫酸銨至30%的濃度，讓混合物攪拌60min以保證沉澱完全；
9 將溶液轉移至離心管中，平衡後於4℃，10000g離心15min，
10 輕輕倒出上清液，將蛋白質顆粒(占20%～30%組分)及上清液保存好；
11 重複步驟6～8，添加硫酸銨至濃度為40%，50%，最後達到80%飽和度，在增加硫酸銨濃度前，離心除去沉澱的蛋白質。
12 在緩衝液中重懸回收的蛋白質沉澱(0～20%，20%～30%，30%～40%，…)，用SDS-PAGE和快速Western印跡分析來分析這些蛋白質沉澱以及最終上清液中的目的蛋白和總蛋白。
