《遞進式強化新型維生素吡咯喹啉醌的生物合成途徑》是依託北京化工大學，由田平芳擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：遞進式強化新型維生素吡咯喹啉醌的生物合成途徑
- 依託單位：北京化工大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：田平芳
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
吡咯喹啉醌是新型維生素，在醫藥、食品及農業等領域具有廣闊套用前景。首先用PCR法克隆肺炎克雷伯氏菌中的吡咯喹啉醌基因簇，構建載體後轉化該菌本身，增加已有的代謝流量。基於RNA聚合酶sigma因子對基因組中啟動子的廣泛識別及親疏差異性，用易錯PCR法構建Sigma基因突變文庫，轉化肺炎克雷伯氏菌，然後篩選吡咯喹啉醌高產菌。為闡明高產機理，進行代謝流量和關鍵基因表達分析；並用抑制性消減雜交法分離差異表達基因，依照GenBank測序圖譜將其進行染色體定位，從中獲悉分布信息；同時利用KEGG資料庫將編碼酶的基因定位於代謝途徑，確定影響產量的關鍵途徑,並用數量遺傳學方法評價關鍵途徑對產量的貢獻率，為後續的途徑耦合奠定基礎。本研究創新地提出了遞進式強化生物合成途徑的新思路，不僅獲得吡咯喹啉醌高產菌，而且為其他大宗發酵菌種的催化途徑改造奠定理論基礎。
結題摘要
吡咯喹啉醌（PQQ）是多功能新型維生素。大腸桿菌不能合成PQQ，但肺炎克雷伯氏菌能合成PQQ，因為具有完整的PQQ基因簇。本研究克隆了大腸桿菌葡萄糖脫氫酶(GDH)基因gcd，構建了重組大腸桿菌BL21/pET28a-gcd。用IPTG誘導後經SDS-PAGE分析表明，該工程菌的GDH表達量約為對照菌的18倍。添加MgCl2能提高GDH的表達量。考慮到PQQ合成與啟動子強度有關，將不同啟動子整合至表達載體，發現卡那黴素抗性啟動子最利於PQQ合成，而且肺炎克雷伯氏菌的PQQ產量高於大腸桿菌。為了消除代謝瓶頸，製備重組菌的細胞勻漿，與活體重組菌相比，無細胞體系的PQQ產量提高約30%，表明胞記憶體在PQQ合成的限速反應，而無細胞體系可解除此限速反應。為刺激PQQ分泌，構建了表達信號肽基因pelb的重組菌大腸桿菌，其PQQ產量達到40.73 mg/L，比對照菌E. coli BL21(pET-28a-pqq)提高了24.36%。此外，兩株菌前3 h發酵的單位菌體產量及單位菌體產率均較高，此後且呈下降趨勢。E. coli BL21(pET-28a-pelb-pqq)在21 h後的PQQ產量及生物量均增加，推測PQQ產量與菌體生物量之間存在協同關係。在大腸桿菌共表達GDH和PQQ基因，雙質粒共存菌的PQQ產量高達199.8 mg/L，其葡萄糖利用率也明顯提高。對肺炎克雷伯氏菌進行紫外和氯化鋰誘變，前者所得菌株的PQQ產量較高。對一株產PQQ的假單胞桿菌的發酵條件進行了最佳化，通過單因素和正交試驗，該菌在250 mL搖瓶的PQQ產量為448 mg/L，在1.5 L發酵罐的PQQ產量達 695 mg/L，這是目前報導未經最佳化或基因改造菌株的較高產量。總之，通過構建若干高產工程菌，該研究進一步闡明了PQQ合成機理，為將來工業生產奠定了基礎。
