退磷酸化

退磷酸化是磷酸基團的除去，對許多生物起著"開/關"作用。防止質粒載體的自身連線，最常用於質粒進行單酶切連線時。退磷酸化是由於DNA連線酶催化DNA連線時需要有磷酸基團的存在，載體在經酶切後會在切點端保留一個磷酸基團。載體去磷酸化後因自身5'端無磷酸基團，因而不可以和自身3'端連線。

載體去磷酸化後3'還是有羥基的，可以與目的片段的5'端磷酸基團連線。載體的5'端和目的片斷的3'-OH不能成鍵，因而形成一個雙鏈各有一個切口的雙鏈環狀DNA，雙鏈的切口會在轉化入大腸桿菌後，在複製的過程中被修復。若不進行退磷酸化處理，在連線反應中載體自身會優先進行連線，導致目的片段插入率降低。