農桿菌轉化法

農桿菌是普遍存在於土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物和裸子植物的受傷部位（受傷處的細胞會分泌大量酚類化合物，從而使農桿菌移向這些細胞），並誘導產生冠癭瘤或髮狀根。

基本介紹

• 中文名：農桿菌轉化法
• 外文名：Agrobacterium mediated transformation
• 別名：農桿菌Boletus介導轉化法

簡介

農桿菌轉化法

根癌農桿菌和髮根農桿菌中細胞中分別含有Ti(Tumour inducing)質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後，可將T-DNA插入到植物基因組中，並且可以通過減數分裂穩定的遺傳給後代，這一特性成為農桿菌介導法植物轉基因的理論基礎。

科研人員將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，藉助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然後通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。農桿菌介導法起初只被用於雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛套用。

原理

選擇一種特製的空質粒載體（如PBI121質粒載體），其上要求含有T-DNA邊界序列（此處可參見詞條雙元表達載體系統），在序列之間含有複製原點、抗性基因、GUS報告基因、Hind Ⅲ和BamH I 等酶切位點（以上這些構成了一個T-DNA區）。先通過雙酶切反應酶切空質粒載體和目的基因，再通過酶連反應連線空質粒載體和目的基因，從而構建成完整的重組質粒。此時重組質粒的T-DNA區包括T-DNA邊界序列、複製原點、突變啟動子片段、GUS報告基因、抗性基因。我們稱這段T-DNA區為目的片段。農桿菌轉化法的原理是構建雙元表達載體系統，由兩種質粒組成，一種是位於大腸桿菌中的穿梭質粒，另一種是位於農桿菌中的輔助性質粒。將重組質粒電轉化到農桿菌感受態細胞中後，用含有重組質粒的農桿菌去侵染植物根部切口，通過輔助性質粒的Vir區表達蛋白與重組質粒T-DNA區（目的片段）的反式作用激活T-DNA的轉移（此處可參見詞條雙元表達載體系統），從而將目的片段整合到植物細胞基因組中。隨著愈傷組織的形成，使得新生細胞均含有該目的片段的基因。

步驟

轉化：目的基因插入Ti質粒的T-DNA上——進入農桿菌——導入植物細胞——目的基因整合到植物染色體的DNA上——目的基因得以穩定維持和表達

1、獲取目的基因：用限制性核酸內切酶切割下目的基因。

2、基因表達載體的構建：將目的基因與載體（大多數選用質粒）用DNA連線酶連線起來。

基因工程圖解

3、將目的基因導入受體細胞：將含目的基因的重組質粒導入農桿菌（農桿菌為受體細胞）。

4、目的基因的檢測與鑑定：用DNA分子雜交技術/分子雜交技術/抗原-抗體雜交/個體生物學水平鑑定（這個方法需要導入重組後的細胞的植物體，詳見第五步） 幾種方法進行檢驗（根據要求選取不同方法）。

5、最後將成功表達的細胞導入植物體內，對植物體進行個體生物學水平鑑定。

整個轉基因體系的建立步驟大致可以歸納為：目的載體的構建---載體的農桿菌轉化---農桿菌與植株共培養---轉化植株的篩選---轉化植株的鑑定。

在每一步中都涉及到很多的方法與技術。目的載體的構建，包括目的基因的克隆、載體的酶切、連線(用限制性核酸內切酶與DNA連線酶），以及測序分析。載體的農桿菌轉化，目前有很成熟的方法，試驗中應注意熱激和冷激的時間。農桿菌與植株的共培養，即為植株轉化實驗，在溶液中加入促進植株愈傷生長的激素能一定程度提高轉化率。轉化植株的篩選，大多是利用抗生素進行篩選的，抗生素的選擇則需根據目的載體確定，設定不同梯度的抗生素對植株進行篩選。轉化植株的鑑定，一般採用PCR法。以上所有的操作，都應該在無菌環境下進行，無菌是植物組培的一項基本，但是重要的要素。

優點

農桿菌Ti質粒轉化系統與其他基因轉化體系相比，具有許多突出的優點：①該轉化體系是模仿或稱之為利用天然的轉化載體系統，成功率高，效果好；

質粒

②農桿菌Ti質粒轉化系統的機理研究得最清楚，方法最成熟，套用也最廣泛；

③農桿菌Ti質粒轉化系統轉化的外源基因以單拷貝為多數，遺傳穩定性好，並且多數符合孟德爾遺傳規律，因此轉基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料；

④農桿菌Ti質粒轉化系統操作比較容易，需要的儀器設備簡單，易於推廣。

作用

農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力。當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農桿菌移向這些細胞，這時農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）可轉移至受體細胞，並且整合到受體細胞染色體的DNA上。根據農桿菌的這種特點，如果將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，並將其插入到植物細胞中染色體的DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達。它是將目的基因導入植物細胞採用最多的方法。