轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善

《轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法》是中國農業科學院生物技術研究所和郭三堆於2005年10月18日申請的發明專利，該專利的申請號為2005101091174，公布號為CN1771792，公布日為2006年5月17日，發明人是郭三堆、張銳、王遠。

《轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法》所述育種方法育成抗蟲性穩定、不育株率和不育度均為100％的轉基因細胞質雄性不育系；育成抗蟲性穩定、對細胞質雄性不育系恢復率和恢復度均達100％的轉基因陸地棉恢復系；抗蟲恢復系與不育系雜交，後代表現出高產、優質、抗蟲等強的超親雜種優勢，一般可比常規對照增產皮棉20％～40％。

2014年11月6日，《轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。

基本介紹

中文名：轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法
公布號：CN1771792
公布日：2006年5月17日
申請號：2005101091174
申請日：2005年10月18日
申請人：中國農業科學院生物技術研究所、郭三堆
地址：北京市海淀區中關村南大街12號
發明人：郭三堆、張銳、王遠
分類號：A01H1/02（2006.01）、A01H1/06（2006.01）
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

雜種優勢是生物界普遍存在的現象，它可以表現在各種經濟性狀、生長發育、生理生化、細胞，以至於分子水平等各個層次上。利用雜種優勢是現代農業提高農作物產量、品質和抗逆性的有效途徑。如玉米、水稻、油菜等農作物雜種優勢帶來的高產和優質對世界食物安全已作出了巨大貢獻。

三系，即雄性不育系、保持系和恢復系，是利用植物細胞質雄性不育進行雜種種子生產（制種）的體系。美國是最早開展三系雜交研究的國家，培育出具有哈克尼西棉細胞質的不育系Des-HAms16和Des-HAms277，並通過把哈克尼西棉的細胞核基因轉移到陸地棉染色體組中去的方法育成兩個恢復系Des-HAF16和Des-HAF277，但由於野生棉細胞質對雜種後代的負效應，以及恢復系育性恢復不完全、波動大，在同一年份里有的恢復好，有的恢復不好（不育），因此未在生產上套用。1980年中國從美國引進哈克尼西棉細胞質不育三系，並相繼育成一批有一定育種價值的材料，且完成了海陸三系和陸海三系配套組合，但因為制種產量低和高優勢組合缺乏，僅在新疆有小面積種植，未實現大面積產業化。2005年10月前，浙江大學用轉基因技術將谷胱甘肽-轉移酶基因（GTS）導入哈克尼西棉細胞質恢復系DES-HAF277中，篩選到一個對雄性不育系具有恢復力的恢復系“浙大強恢”，與受體恢復系相比，其對不育系的恢復力提高25.8％，F1不孕籽率降低10.1％，證明了GTS對棉花花粉育性有明顯的促進作用，但也未達到完全恢復以及見在生產上套用的報導。2005年10月前，國際和中國國內棉花雜交種子主要通過“人工去雄授粉法”獲得，但它費工、費時且成本高，大面積套用受到限制。

同時，利用生物技術手段可以獲得對特定害蟲有殺蟲作用的轉基因植物，例如在世界上大面積推廣套用的轉Bt基因抗蟲棉、抗蟲玉米等，即是將異源抗蟲基因轉化棉花和玉米，篩選獲得的轉基因植株並進一步進行品種選育，最終培育出可大面積套用的轉基因棉花和玉米品種。並且，為獲得特定害蟲難以產生抗性的轉基因植物，可以採用同時轉化兩種或兩種以上不同殺蟲基因的方式。

發明內容

專利目的

《轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法》提供了一種將Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci抗蟲基因轉化棉花保持系和恢復系，育成轉基因抗蟲保持系、不育系和恢復系，其中轉基因抗蟲不育系和恢復系選配可獲得強優勢組合的轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法。

技術方案

《轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法》採取下列措施。

1）採用轉基因方法，將異源抗蟲基因（Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci）導入陸地棉品種（系）中，育成轉抗蟲基因的保持系；

2）採用回交轉育的方法，以轉抗蟲基因的保持係為輪迴親本，育成轉抗蟲基因的不育系及其衍生系，其不育率和不育度均為100％；

3）採用雜交的方法，將0-613-2R中的恢復基因與中國常規陸地棉中的恢復加強基因聚合在一起，使獲得的新型陸地棉恢復系對步驟2獲得的不育系具有完全恢復能力；

4）採用轉基因方法，將異源抗蟲基因（Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci）導入新型陸地棉恢復系中，育成轉抗蟲基因的恢復系及其衍生系，其恢復率和恢復度均為100％；

5）以轉抗蟲基因的不育係為母本，以恢復系或轉抗蟲基因恢復係為父本，測交並篩選出在產量、品質和抗性上具有強優勢的雜種F1組合。

改善效果

《轉抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法》所提供的陸地棉恢復系及轉基因抗蟲恢復系，聚合了恢復系0-613-2中的恢復基因和中國陸地棉中的恢復加強基因，使雜種F1的可育株率和可育度均達到了100％，從而有效地克服了中國國內外2005年10月前三系雜交棉，尤其是陸陸三系雜交棉雜種F1可育度低的缺陷。同時，該發明所提供的轉抗蟲基因的保持系、不育系和恢復系，其轉化的抗蟲基因包括Bt GFM cry1A單價抗蟲基因、Bt GFM cry1A+cpti雙價抗蟲基因以及cryci融合抗蟲基因三類不同的抗蟲基因，其中Bt GFM cry1A+cpti雙價抗蟲基因以及cryci融合抗蟲基因的表達產物均包含兩類殺蟲機理不同、殺蟲譜互補且具有協同增效作用的兩種抗蟲活性蛋白質，即Bt毒蛋白和豇豆胰蛋白酶抑制劑，選育獲得的轉雙價抗蟲基因和轉融合抗蟲基因的棉花不僅抗蟲效率達90％以上，而且在生長發育的中後期，抗蟲效率明顯高於轉單價抗蟲基因的棉花。另外，實驗室汰選結果表明，轉雙價抗蟲基因的棉花可有效延緩棉鈴蟲產生抗性的進程。2003-2004年，抗蟲三系雜交棉銀棉2號在全國棉花區試黃河流域春棉組中，籽棉、皮棉、霜前皮棉兩年平均分別比對照中棉所41增產21.1％、26.4％和29.1％，均居兩年參試品種第一位。

權利要求

1、一種轉抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術及其套用，其特徵在於它的步驟如下：

1）採用基因導入技術，將單價、雙價、融合抗蟲基因導入系統選育的棉花恢復系中，育成對細胞質雄性不育系的育性恢復率達100％的、抗蟲性穩定的轉抗蟲基因恢復系及其衍生系；

2）採用基因導入技術，將單價、雙價、融合抗蟲基因導入農藝性狀優良的陸地棉品種中，育成對細胞質雄性不育系的保持率和保持度達100％的、抗蟲性穩定的轉抗蟲基因保持系及其衍生系；

3）採用不育系與保持系雜交轉育的方法，將抗蟲基因轉育到細胞質不育系中，育成對棉鈴蟲和紅鈴蟲等鱗翅目害蟲具有抗蟲性的轉基因抗蟲不育系及其衍生系；

4）以抗蟲不育係為母本，以抗蟲恢復係為父本，測交和篩選出抗蟲雜種F1組合；

5）F1組合經過品種區域試驗和生產試驗，選育出品質優良、抗蟲性強、一般可增產20～30％的能用於生產的F1組合。

2、根據權利要求1所述的一種轉抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術及其套用，其特徵在於所說的抗蟲基因是指GFMCry1A單價抗蟲基因；GFMCry1A加cpti雙價抗蟲基因和GFMCry1A基因與cpti基因相融合的融合抗蟲基因cryci，基因的表達產物對棉鈴蟲和紅鈴蟲等鱗翅目害蟲有毒殺作用。

3、根據權利要求1所述的一種轉抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術及其套用，其特徵在於所說的轉抗蟲基因的三系是指陸地棉細胞質雄性不育系、保持系和恢復系，並且三系均具有穩定的抗蟲性。

4、根據權利要求1所述的一種轉抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術及其套用，其特徵在於所說的轉抗蟲基因是指用基因導入和轉育方法，將抗蟲基因轉入三系中。

5、根據權利要求1-4其中之一所述的一種轉抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種方法，其特徵在於所說的不育是指陸地棉細胞質與細胞核互作的質核互作雄性不育遺傳類型。

6、根據權利要求1所述的一種轉抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種方法，其特徵在於所說的測交和篩選是指雄性不育系與其相應恢復系雜交所獲雜種F在產量、品質和抗蟲性上的優勢測定和選擇。

7、根據權利要求1所述的一種轉抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種方法，其特徵在於所說的分子育種是指從分子水平的層次上，用基因工程技術與常規轉育方法相結合，培育三系雜交棉新種子。

8、根據權利要求1所述的一種轉抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種方法，其特徵在於將轉抗蟲基因恢復系、轉抗蟲基因保持系和轉抗蟲基因不育系作為基礎材料，進一步選育抗蟲恢復系、抗蟲保持系和抗蟲不育系。

9、根據權利要求1所述的轉抗蟲基因恢復系、轉抗蟲基因保持系和轉抗蟲基因不育系在棉花生產中的套用。

實施方式

實施例一：轉抗蟲基因陸地棉保持系選育

利用農桿菌介導的葉盤法和花粉管通道法，將Bt GFM cry1A單價抗蟲基因（ZL95119563.8）、Bt GFM cry1A+cpti雙價抗蟲基因（ZL98102885.3）以及cryci融合抗蟲基因（200510076823.3）三類不同的抗蟲基因分別導入晉棉7號、中棉所12、中棉所19、中植372、泗棉3號、蘇棉8號、蘇棉12號、泗陽167、泗陽168、石遠321、新陸早4號、新陸早7號、新陸早8號、遼棉15，以及3517、541、916、C6524、Q0101、蘇引A、蘇引B、蘇引C以及低酚棉W8等優良陸地棉品種（系）中，經過分子檢測和抗蟲性鑑定，獲得近600份抗蟲性超過90％的轉抗蟲基因棉花種質資源材料，並在此基礎上，通過系選，獲得70多個高產、優質、抗病蟲的品系，選育出通過省級和國家級審定的晉棉26號、國抗12號、國抗1號、國抗22號、魯棉研16、晉棉31、鄂抗蟲棉1號、晉棉34、魯棉研18號、魯棉研21號、魯棉研22號、魯棉研19號、邯鄲109等共13個單價抗蟲常規棉品種，和sGK321、新研96-48、中棉所41、中棉所45、中棉所51（棕色）、SGK3、中棉所50等共7個雙價抗蟲常規棉品種。所獲得的這些抗蟲常規陸地棉品種（系）均可作為轉抗蟲基因陸地棉保持系。

實施例二：轉抗蟲基因陸地棉不育系獲得

以具有陸地棉胞質的雄性不育系104-7A為起始不育系，以生產上廣泛種植，具有獨立自主智慧財產權的優良抗蟲品種或品係為保持系，經過連續多代回交轉育，育成具有陸地棉細胞質的棉花雄性不育系40多個，其中穩定的單價抗蟲高代不育系包括國抗12A，魯棉研21A、魯棉研22A、魯棉研19A、國抗19A、K9A、C21A等7個，穩定的雙價抗蟲高代不育系包括中棉所41A，sGK321A，新研96-48A，中棉所45A，P03A，P05A、17-79A，P80A、5-2A，I-4A，2921A，C035A、HDA，NDA，43A、652A，653A，S-25A，S-56A，L14-343A等20個。在這些不育系中，國抗12A、魯棉研21A、中棉所41A、sGK321A、新研96-48A、17-79A、P03A、P05A具有高配合力，與恢復系選配出的優良組合一般比抗蟲常規陸地棉品種增產15％以上。

實施例三：陸地棉恢復系及轉抗蟲基因恢復系選育

以0-613-2R為起始恢復系，與生產上廣泛種植的常規陸地棉雜交後並與不育系測配，篩選獲得聚合了0-613-2R中的恢復基因以及常規陸地棉中的恢復加強基因的恢復系，並自交純合，育成新型恢復系18R、19R和20R。新型恢復系與104-7A來源的不育系雜交，其F1的恢復株率和恢復度均達到了100％，而且可育性穩定。在此基礎上，利用花粉管通道法分期、分批進行Bt GFM cry1A單價抗蟲基因（ZL95119563.8）、Bt GFM cry1A+cpti雙價抗蟲基因（ZL98102885.3）以及cryci融合抗蟲基因（200510076823.3）三類不同的抗蟲基因導入，經過卡那黴素初篩、PCR分子鑑定，2005年10月前已獲得轉單價抗蟲基因的T0代恢復系32株；轉雙價抗蟲基因的T0代恢復系26株，轉融合抗蟲基因的T0代恢復系8株。

將T0代轉基因植株種成株行，觀察轉基因植株的農藝性狀、抗蟲基因的遺傳穩定性以及抗蟲基因的表達特性，同時與不育系雜交判斷其育性恢復能力。經過篩選，將農藝性狀表現優良、抗蟲基因遺傳穩定且抗蟲性好、育性恢復完全的株行保留下來繼續進行系選和配合力測定，2005年10月前已獲得配合力好、恢復性狀穩定的抗蟲恢復系AsR（單價）、BsR（單價）、CsR（單價）、R1F-8（雙價）、14R（雙價）、30R（雙價）、FK18R（融合）等7個。

實施例四：抗蟲三系雜交棉組合選配

利用選育的恢復系或抗蟲恢復系與抗蟲不育系組配，2005年10月前已篩選出皮棉超過常規抗蟲對照sGK32115％的組合8個，而兩個優質棉組合L14AF1、P80AF1也分別比對照增產12％和6％，抗蟲三系雜交棉銀棉2號在全國棉花區試黃河流域春棉組中，籽棉、皮棉、霜前皮棉兩年平均分別比對照中棉所41增產21.1％、26.4％和29.1％，均居兩年參試品種第一位。於2005年通過國家棉花專業委員會的審定，成為第一個通過國家審定的三系雜交棉。2005年10月前，尚有GKz11、GKz28、sGKz6、sGKz34等4個組合正在參加全國棉花區試。

榮譽表彰