《負調控變態反應融合分子構建及其作用機制研究》是依託河北大學，由劉中成擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：負調控變態反應融合分子構建及其作用機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：劉中成
- 依託單位：河北大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
阻斷IgE/FcεRI信號通路己經成為抗變態反應性疾病治療的研究熱點。我們利用噬菌體肽庫展示技術篩選到與IgE穩定結合的12肽分子（A6），初步試驗證實結合肽A6可同時與游離IgE或效應細胞膜表面IgE相結合，阻斷IgE/FcεRI信號通路。以此為契機擬構建具有雙功能活性的IgE結合肽與抑制性受體FcγRIIB結合肽的融合分子，可特異性與FcγRIIB結合，同時摒棄了直接偶聯FcεRI與FcγRIIB的弊端，僅負調控已結合IgE的效應細胞，達到阻斷IgE/FcεRI信號通路的目的。本研究主要在細胞水平和動物水平對融合蛋白抗變態反應活性和相關機制進行研究，同時，利用計算機模建和構建缺失突變體的方法分析結合肽A6與IgE分子結合表位。本研究將為利用基因工程構建的負調控信號分子治療變態反應性疾病提供新的方法，同時為揭示結合肽A6與IgE複合物的空間構象，開發其他小肽或肽似物提有意義的線索。
結題摘要
變態反應性疾病已經成為一種常見病和流行病，但目前仍沒有肯定的治癒方法。以IgE/FcεRI信號通路為靶點設計藥物，阻斷IgE與其高親和力受體（FcεRI）的結合及下游信號傳遞己經成為抗變態反應性疾病藥物的研究熱點。近年來，利用免疫負調控作用，抑制肥大細胞和嗜鹼粒細胞釋放炎性介質和細胞因子，為變態反應性疾病的免疫治療開闢了新的途徑，其中FcγRIIB受體介導的免疫負調控作用逐漸收到眾多學者的關注。本項目首先成功克隆Cε3-Cε4和FcγRIIB基因，製備了重組的高純度Fcε3-4蛋白和FcγRIIB胞外區蛋白。利用噬菌體隨機多肽展示技術，採用固相篩選法，分別篩選Cε3-Cε4蛋白和FcγRIIB胞外區蛋白結合肽。通過對固相篩選法中靶分子濃度、作用溫度、去污劑及淘選輪數等關鍵環節進行最佳化，建立了適合Cε3-Cε4蛋白和FcγRIIB胞外區蛋白的噬菌體隨機多肽展示技術體系，獲得了高特異性、高親和力的Cε3-Cε4蛋白結合肽P20（A6）以及FcγRIIB胞外區結合肽P16，並對所獲結合肽生物學活性進行了分析。同時，構建了穩定表達FcγRIIB的CHO細胞株，為評價FcγRIIB蛋白結合肽功能提供條件。為評價融合肽ε-γ功能，本實驗利用計算機輔助設計並結合具體實驗，對連線肽（linker）進行最佳化，最終選擇(G-S-G)6作為linker，將IgE結合肽P20（A6）與FcγRIIB結合肽P16融合。以DNP-IgE和DNP-BSA為變應原直接誘導動物變態反應，建立快速PCA模型；以RBL-2H3細胞為基礎，以DNP-IgE和DNP-BSA為變應原建立了肥大細胞脫顆粒模型。體內、外驗證了融合蛋白ε-γ具有雙功能活性，可抑制變態反應進程，且對正常肥大細胞不引發脫顆粒等變態反應。利用計算機輔助模建結合缺失突變體分析，發現P20可能通過氫鍵與Cε3-Cε4在ARG-342、SER-432、GLU-472位置結合。此外，製備了穩定表達人FcεRIα的RBL-2H3，證實了人、鼠IgE與其受體結合具有種屬特異性，鼠IgE可與人IgE受體結合，而人IgE不能與鼠IgE受體結合。本項目結果將為利用基因工程構建負調控信號分子治療變態反應性疾病提供參考，同時也為開發其他小肽或肽似物提有意義的線索。
