豬繁殖與呼吸綜合徵病毒非結構蛋白NSP9功能研究

《豬繁殖與呼吸綜合徵病毒非結構蛋白NSP9功能研究》是依託華南農業大學，由張桂紅擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：豬繁殖與呼吸綜合徵病毒非結構蛋白NSP9功能研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：張桂紅
• 依託單位：華南農業大學

項目摘要

豬繁殖與呼吸綜合徵（PRRS）是目前嚴重危害我國乃至世界養豬業最重要的傳染病，而2006年在我國首次爆發的高致病性藍耳病給我國養豬業造成了重要的經濟損失，其致病能力顯著增強的現象引起人們高度關注。本研究擬在過去的研究工作基礎上，製備nsp9單克隆抗體，研究nsp9在病毒感染中的表達量變化；同時利用本課題組已建立的穩定反向遺傳操作平台技術，研究PRRSV nsp9在病毒複製與轉錄過程中的作用，分析變異PRRSV與經典PRRSV毒株NSP9功能的差異，為揭示藍耳病病毒感染和致病的分子機理提供理論依據，該研究結果還可以為研製豬繁殖與呼吸綜合徵病毒的高效疫苗奠定基礎，進而控制豬繁殖與呼吸綜合徵，減少對畜牧業的危害。

結題摘要

豬繁殖與呼吸綜合徵（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）首先在北美洲和歐洲發現，我國於1995年首次分離到PRRS病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）。2006年以來我國以JXA1為代表的高致病性藍耳病，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。 本項目中我們首先從廣東省各個地區的病料中，通過RT-PCR等技術，總共等到25條Nsp9的序列，通過分析表明與JXA1株處於同一個分支上，說明了高致病型PRRSV在廣東地區廣泛流行。為了研究Nsp9基因對於病毒生物學活性的影響，我們製備了針對Nsp9的多克隆抗體和單克隆抗體，發現Nsp9蛋白主要存在細胞質中，且在病毒感染的36小時後，Nsp9基因的數量達到最大。同時我們構建出缺失Nsp9基因的全長質粒，發現不能進行拯救出病毒，說明Nsp9蛋白對於病毒的拯救很重要。而後我們利用siRNA的設計原則，針對PRRSV Nsp9基因的保守區，構建了四組干擾質粒。通過間接免疫螢光，RT-PCR等驗證了干擾質粒對PRRSV複製的抑制作用。由於臨床上高致病PRRSV和經典型PRRSV對於豬的致病性有很大的差別。為了研究不同致病性病毒的Nsp9基因對於病毒生物學活性的影響。我們將CH-1R的Nsp9序列替換到XH-GD的感染性克隆上，成功拯救病毒。之後我們對拯救病毒的生物學特性進行探索。我們發現拯救病毒的生長速度和滴度高於親本毒株，低於CH-1R，我們推測CH-1R的聚合酶有助於提高病毒的滴度。 綜上所述，我們發現廣東地區流行的毒株的Nsp9基因與以JXA1為代表的高致病藍耳病相似；通過真核表達，間接免疫螢光等技術，我們證明了Nsp9蛋白在感染後的36小時表達量最高，且Nsp9蛋白主要表達在細胞質中。通過反向遺傳技術，我們證明Nsp9對於病毒的拯救是必需的，同時我們針對Nsp9基因設計的siRNA能很好的抑制病毒複製。將強弱毒的Nsp9基因進行替換，替換了CH-1R Nsp9序列的XH-GD嵌合病毒表現出更快的生長速度和更高的滴度。說明CH-1R的Nsp9的酶活性要高於XH-GD Nsp9的酶活性。同時我們製備了針對Nsp9蛋白的多克隆和單克隆抗體，為下一步的研究打下來堅實的基礎。