II型PRRSV重要抗原表位的篩選及其生物學功能的研究

《II型PRRSV重要抗原表位的篩選及其生物學功能的研究》是依託華南農業大學，由王衡擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：II型PRRSV重要抗原表位的篩選及其生物學功能的研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：王衡
• 依託單位：華南農業大學

項目摘要

豬繁殖與呼吸道綜合徵病毒感染宿主後可誘發靶細胞凋亡；可使宿主出現持續帶毒現象和抗體依賴性增強現象；病毒自身胺基酸可組成誘騙表位；病毒GP5結構蛋白的糖基化位點可產生多糖禁止現象。同時，病毒自身易突變，並存在多種基因型和表現型。目前多採用馴化病毒，製備滅活疫苗、載體疫苗和多價疫苗，研製新型佐劑，構建重組病毒及建立清除性免疫等方法用於該病毒高效疫苗研究和病毒淨化。鑒於各種方法存在的潛在風險，為避免活病毒自身的突變性和致病性、避免外源載體的免疫干擾性、避免滅活病毒低細胞免疫誘導性以及重組病毒的生物安全風險性，本研究將藉助小分子多肽的幫助，首次套用國內經典II型PRRSV毒株全病毒單克隆抗體與噬菌體隨機12肽庫相互作用，進行病毒重要表位的篩選，以期待獲得用於免疫防治和檢測方法研究的具有較好生物活性的小分子短肽，旨在為新型疫苗的研發、快速診斷方法的研究以及致病機理的探尋提供新的線索。

結題摘要

豬繁殖與呼吸綜合徵病毒（PRRSV）非結構蛋白7（nsp7）被認為可以作為理想的靶分子用於PRRSV血清學診斷方法的建立。原因由於該蛋白在大腸桿菌表達系統中，可以可溶形式表達；機體感染PRRSV後，nsp7抗體可持續存在至感染後202天；在同一基因型病毒之間nsp7編碼蛋白非常保守，不同基因型之間差異較大。另有研究表明，以nsp7蛋白為抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）與目前全球廣泛使用的Idexx ELISA試劑盒檢測方法具有非常高的一致性。以上證據表明，nsp7可作為重要的檢測因子，用於PRRSV的檢測，但到目前為止，該蛋白免疫活性、生物功能及其抗原表位分布情況還沒有明確研究結果。本研究首先獲得nsp7可溶性重組蛋白，以其為抗原製備了效價高、特異性強的抗nsp7蛋白兔源多克隆抗體。實驗結果顯示，該多克隆抗體可以和大腸桿菌表達的nsp7α、nsp7β重組蛋白發生特異性結合，並有效用於病毒感染Marc-145細胞後其nsp7蛋白分布情況的原位檢測；不同稀釋倍數的抗nsp7多克隆抗體均可對病毒的複製產生抑制作用。套用噬菌體隨機肽庫淘選技術對PRRSV nsp7蛋白進行特異性親和多肽的篩選。經過6輪生物淘選後，獲得5條共有十二肽序列。其中噬菌體4和5展示的多肽共同含有一致的多肽序列CD##WC。根據篩選噬菌體與nsp7的結合能力，合成三條多肽，並對部分多肽進行FITC標記。免疫螢光結果表明，三條多肽可用於感染細胞中nsp7的檢測；病毒抑制試驗表明，多肽5和6表現出有效的病毒抑制能力，並在感染後36和48h時，其抑制作用表現出劑量依賴性。選用FITC標記的多肽5用於nsp7在感染細胞內定位的檢測。結果發現，該蛋白在PRRSV感染細胞內主要分布於細胞核周圍，與nsp7單抗檢測結果一致。同時，本研究製備三株nsp7特異性單克隆抗體，該單抗可用於nsp7在PRRSV感染組織內和感染細胞內的生物檢測。並套用噬菌體隨機肽庫淘選技術對其進行篩選，以探尋nsp7抗原分布特性，結果表明，本研究所發現的表位位於type II PRRSV nsp7β中，序列為N153AWGDEDRLN162，該表位可用於PRRSV陽性血清的檢測。今後研究中，可圍繞該表位建立PRRSV新型檢測方法，以及探索可用區分滅活疫苗度和野毒，以及區分I型和II型PRRSV的檢測方法的研究。