豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,附圖

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》是中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所於2007年2月1日申請的專利，該專利的公布號為CN101235363，授權公布日為2008年8月6日，發明人是馮力、王承寶、時洪艷、陳建飛、佟有恩、王明、馬思奇。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》公開了一種豬傳染性胃腸炎華毒（H）弱毒疫苗株（Transmissible gastroenteritis virus）及其套用。該發明弱毒疫苗株的微生物保藏號是：CCTCC－V200609。該發明TGEV弱毒株安全性好，對於豬傳染性胃腸炎（TGE）病毒具有良好的免疫保護率。該發明弱毒株可套用於製備成診斷豬傳染性胃腸炎的診斷試劑，還可套用於製備成防治豬傳染性胃腸炎的單苗或聯苗（活或滅活疫苗）等。

2020年7月14日，《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。

（概述圖為《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》摘要附圖）

基本介紹

中文名：豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用
申請人：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
申請日：2007年2月1日
申請號：2007100030454
公布號：CN101235363
公布日：2008年8月6日
發明人：馮力、王承寶、時洪艷、陳建飛、佟有恩、王明、馬思奇
地址：黑龍江省哈爾濱市南崗區馬端街427號
Int. Cl.：C12N7/00(2006.01)、C12N15/50(2006.01)、A61K39/225(2006.01)、A61K35/76(2006.01)、A61P31/12(2006.01)
代理機構：北京科龍寰宇智慧財產權代理有限責任公司
代理人：孫皓晨
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,獲獎表彰,

專利背景

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus）引起的一種高度接觸性消化道急性病毒性傳染病。以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和10日齡以內的仔豬高死亡率為特徵。該病對各種年齡的豬只均易感，但以2周齡以下的仔豬最為易感，病死率可高達100％。

該病的病原為主傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV），屬於nidovirales病毒目冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）的成員。有囊膜，形態多樣，呈球形或橢球形，直徑90～160納米，在雙層囊膜上面，覆有10～24納米的球棒狀纖突，間隔較寬。TGEV只有一個血清型。

體外培養TGEV的敏感的細胞有豬甲狀腺細胞、豬睪丸細胞、胎豬腎細胞和仔豬腎細胞。IBRS-2、ST、PK15細胞系是實驗室中進行病毒增殖常用的細胞系。病毒感染後的複製、增殖機制與本屬其他成員相似，病毒的成熟發生於細胞漿中，通過內質網出芽，在細胞漿的空泡中常可見到病毒粒子。

2007年前尚無特效的抗該病毒的製劑，臨床上多採用對症療法以減輕症狀和減少病死率。治療原則是：減少飢餓，防止脫水和酸中毒。可採用輸液、補充電解質如葡萄糖鹽水和營養液，以及有助於消化的藥物，如乳酶生、麥芽粉、蛋白酶等，同時加強保溫措施，這些措施可以較少3～4日齡以上的小豬的病死率。TGE常與其他腸道菌如大腸桿菌等發生混合感染，常用的抗菌藥物有土黴素、呋喃類、磺胺類等藥物治療，以緩解合併症症狀，減少病死率。

2007年前尚缺乏一種有效的防治豬傳染性胃腸炎病毒的疫苗。

發明內容

專利目的

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》所要解決的技術問題是提供一種新的豬傳染性胃腸炎華毒弱毒（H）疫苗株（Transmissible gastroenteritis virus，TGE），用該弱毒疫苗株所製備的疫苗對於豬傳染性胃腸炎（TGE）病毒具有良好的保護效力。

技術方案

一種豬傳染性胃腸炎華毒（H）弱毒疫苗株（Transmissible gastroenteritis virus，TGE），其微生物保藏號是：CCTCC-V200609；分類命名：豬傳染性胃腸炎病毒弱毒疫苗株TGE H；保藏時間是：2006年11月16日；保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏地址：武漢大學中國典型培養物保藏中心。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》採用培養液中加二甲基亞碸處理細胞的方法使27-4代華毒株強毒適應於胎豬腎細胞，並傳至165代，自92代進行了5輪克隆純化，並自116代開始選直徑1毫米以內小空斑傳代。第100代以後的病毒滴度為10～10TCID₅₀/0.3毫升。以鼻內途徑免疫接種的母豬中和抗體價最高，持續期最長為10個月。第120及135代毒分別作豬體連續傳代5及6代，均未見毒力增強，將我們克隆培育的弱毒疫苗毒株命名為豬傳染性胃腸炎（TGE）華毒弱毒（H）疫苗株。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》TGEV弱毒株的形態學觀察：病毒細胞培養物上清離心後，將收穫的病毒懸液5000rpm離心30分鐘，取上清，然後上清液15000rpm超速離心，4℃離心2h，沉澱用適量pH7.0PBS溶液懸浮，磷鎢酸負染電鏡檢查。結果可見到典型的冠狀病毒粒子的照片，病毒粒子呈球形，大小100～180納米，具有纖突。

通過對《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》TGE H毒株的基因序列進行分析，發現了本疫苗毒株的特有基因序列特徵，其特有基因序列特徵如下：ORF3基因序列總長度為1203bp（SEQ IDNO：1），其中，ORF3a的基因序列總長度為193bp（SEQ ID NO：2），ORF3b的基因序列總長度為：735bp（SEQ ID NO：3），ORF3a-3b之間的基因間隔序列總長度為：87bp（SEQ ID NO：4）。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》TGEV弱毒株的適應細胞比較廣泛，例如，可以是豬腎原代細胞、豬甲狀腺細胞、IBRS-2、ST或PK15等細胞。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株製備成疫苗的方法：

選用生長良好的PK或PK15細胞，倒掉培養液後，換以含5％病毒種子液的新鮮培養液（乳漢液或），置37℃繼續培養。接毒後，每日觀察。發現生長異常、污染的細胞應廢棄。培養2-3日後，約有80％的細胞出現病變，並與對照細胞差異顯著時，即可收穫，經3次凍融後，置-20℃保存。將收穫的兩種病毒每5瓶毒液為一組分別取樣，進行無菌檢驗，應無細菌生長工。效價均應≥106.0TCID50/m1。將檢驗合格的豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉細胞毒液等量混合液與保護劑（蔗糖明膠保護劑，明膠49g；蔗糖280g加無離子水700毫升加熱溶解後，分裝，110～116℃滅菌30～60分鐘。）按7∶1混合（病毒液保持在10-20℃，保護劑40-50℃），充分搖均後分裝，邊分裝邊搖動，8毫升疫苗瓶分裝量為2～3毫升，迅速進行冷凍真空乾燥。

將《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》疫苗分6批次對3日齡仔豬的主動免疫保護率為98.1％（101/103），被動免疫的保護率98.5％（135/137），而對照組的發病率均在90％以上，表明該發明疫苗對於豬傳染性胃腸炎（TGE）病毒具有良好的免疫保護率。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株的安全性好，安全性試驗結果表明，該發明弱毒株對妊娠母豬、仔豬等各年齡豬只均安全無副反應。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》疫苗免疫的主要目的是保護仔豬，免疫所遵循的原則是乳汁免疫（即被動免疫），通常對妊娠的母豬於產前45d或15d進行肌內、鼻內各接種1毫升，仔豬出生後，從乳汁中獲得保護性抗體，被動免疫保護率在95％以上。本疫苗用於主動免疫時，主要用於未接種TGE疫苗且受本並威脅的豬群的仔豬。生後1-2日齡的仔豬即可進行口服接種，免疫里產生期為5-7d。該發明疫苗免疫效果已達到或超過外國同類疫苗，與日本的TO163比較試驗結果，該發明疫苗免疫效果比TO163高13.7％。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》疫苗的使用方法：

（1）接種途徑滴鼻、口服、後海穴位注射（尾根與肛門之間的凹陷處）、肌肉注射。

（2）接種劑量：（1頭份）。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》疫苗的免疫持續期是母豬為1產，其它豬只6個月。

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株套用範圍較寬，例如，可套用於製備成診斷豬傳染性胃腸炎的診斷試劑，還可套用於製備成單苗或聯苗（活或滅活疫苗）疫苗等。

附圖說明

圖1《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株與Purdue TGEV毒株的序列相比結果。

圖2《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株與Miller M6毒株的序列相比結果。

圖3《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株與Miller M60毒株的序列相比結果。

圖4《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株與Purdue P115毒株的序列相比結果。

圖5《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株與SC-Y毒株的序列相比結果。

圖6《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株與TS毒株的序列相比結果。

圖7《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株與virulent Purdue毒株的序列相比結果。

圖8102代弱毒疫苗對中和抗體效價的影響。

圖9135代弱毒疫苗對中和抗體效價的影響。

技術領域

《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》涉及弱毒疫苗株，尤其涉及豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用，屬於生物醫藥領域。

權利要求

1.豬傳染性胃腸炎華毒H弱毒疫苗株，其微生物保藏號是：CCTCCNO：V200609。

2.按照權利要求1的弱毒疫苗株，其特徵在於，所述的弱毒疫苗株的ORF3基因序列為SEQ ID NO：1所示。

3.按照權利要求2的弱毒疫苗株，其特徵在於，所述的ORF3基因主要由ORF3a、ORF3b和ORF3a-3b之間的基因間隔序列所組成；其中ORF3a的基因序列為SEQ ID NO：2所示，ORF3b的基因序列為SEQ IDNO：3所示，ORF3a-3b之間的基因間隔序列為SEQ ID NO：4所示。

4.一種防治豬傳染性胃腸炎的疫苗組合物，由權利要求1的弱毒疫苗株和藥學上可接受的佐劑組成。

5.權利要求1的弱毒疫苗株在製備防治豬傳染性胃腸炎藥物中的用途。

6.權利要求1的弱毒疫苗株在製備診斷豬傳染性胃腸炎試劑中的用途。

實施方式

實施例1 《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》豬傳染性胃腸炎（TGE）華毒弱毒（H）疫苗株的製備

採用乳漢液中加二甲基亞碸處理豬腎元代細胞的方法使27～4代華毒株（由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所分離、鑑定、保藏）強毒適應於胎豬腎細胞，並傳至165代，自92代進行了5輪克隆純化，並自116代開始選直徑1毫米以內小空斑傳代。第100代以後的病毒滴度為10～10TCID₅₀/0.3毫升。以鼻內途徑免疫接種的母豬中和抗體價最高，持續期最長為10個月。第120及135代毒分別作豬體連續傳代5及6代，均未見毒力增強，將所克隆培育的弱毒疫苗毒株命名為豬傳染性胃腸炎（TGE）華毒弱毒（H）疫苗株並提交保藏，其微生物保藏號是：CCTCC-V200609；保藏時間是：2006年11月16日；保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏地址：武漢大學中國典型培養物保藏中心。

試驗例1 《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》豬傳染性胃腸炎（TGE）華毒弱毒（H）疫苗株的基因序列特徵分析

根據GenBank中發表的Purdure TGEV毒株（AJ271965）的序列設計一對引物，用於擴增TGEV H弱毒株-疫苗株（165代）的ORF3序列，引物分別為：

TGEVORF3U：5`-AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3`

TGEVORF3L：5`-CAACAGGAACCAGAAAATGA-3`

最終的測序工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

上海生工測序後的TGEV H弱毒株-疫苗株（165代）ORF3基因的測序，根據所測得的序列結果顯示：與國外的毒株進行Blast比對，然後去掉不屬於ORF3的序列，最終得出的TGEV H弱毒株-疫苗株（165代）ORF3基因序列總長度為1203bp（SEQ ID NO：1）。

其中，ORF3a的基因序列總長度為193bp（SEQ ID NO：2），ORF3b的基因序列總長度為735bp（SEQ ID NO：3），ORF3a-3b之間的基因間隔序列總長度為87bp（SEQID NO：4）。

根據所測得的TGEV H弱毒株-疫苗株（165代）ORF3基因的序列，與國外的毒株進行比對和序列分析得出以下結論：

（1）、與Purdue TGEV毒株的序列相比，TGEV H弱毒株與Purdue毒株的同源性為94.31％，TGEV H弱毒株從ORF3序列的ATG開始的第193為到221位一共缺失了29個核苷酸，具體缺失的核苷酸序列為：

TCAATAGTCATATAGTTGTTTAATATCAT，

其中ORF3a缺失了24個核苷酸，具體缺失為：

TCAATAGTCATATAGTTGTTTAAT；

在ORF3a和ORF3b之間的間隔序列缺失了5個核苷酸，具體缺失為：ATCAT。

從ORF3的ATG上游序列的第60位到第75位一共缺失了16個核苷酸，也就是說在TGEV H弱毒株的S基因和ORF3基因之間的核苷酸序列存在缺失，具體的缺失序列為：TTTCTGCTAGAGAATT。

具體的比對結果見圖1。

（2）、與Miller M6毒株的序列相比，TGEV H弱毒株與Miller M6毒株的同源性達到99.5％，只是存在點突變。具體的比對結果見圖2。

（3）、與Miller M60毒株的序列相比，TGEV H弱毒株與Miller M6毒株的同源性為55.36％，MillerM60毒株缺失了531個核苷酸，具體的比對結果見圖3。

（4）、與Purdue P115毒株的序列相比，TGEV H弱毒株與Purdue P115毒株的同源性為90.83％，Purdue P115毒株在S基因和ORF3基因之間存在缺失，按照設計的引物擴增的序列可知，2007年前缺失了大約56個核苷酸，2007年前所知的具體的缺失為：

AATTGAAAAAGTGCACGTCCATTAAATTTAAAATGTTAATTTTATTATCTGCTATAA，不過具體在Purdue P115毒株在S基因和ORF3基因之間缺失多少核苷酸還有待於進一步的研究。

而TGEV H弱毒株則在從ORF3序列的ATG開始的第193為到221位一共缺失了29個核苷酸，具體缺失的核苷酸序列為：TCAATAGTCATATAGTTGTTTAATATCAT。比對結果見圖4。

（5）、與SC-Y毒株的序列相比，TGEV H弱毒株與SC-Y毒株的同源性為90.75％，SC-Y毒株在S基因和ORF3基因之間存在缺失，按照設計的引物擴增的序列可知，2007年前缺失了大約56個核苷酸，2007年前所知的具體的缺失為：

AATTGAAAAAGTGCACGTCCATTAAATTTAAAATGTTAATTTTATTATCTGCTATAA，不過具體在SC-Y毒株在S基因和ORF3基因之間缺失多少核苷酸還有待於進一步的研究。

而TGEV H弱毒株則在從ORF3序列的ATG開始的第193為到221位一共缺失了29個核苷酸，具體缺失的核苷酸序列為：TCAATAGTCATATAGTTGTTTAATATCAT。比對結果見圖5。

（6）、與TS毒株的序列相比，TGEV H弱毒株與TS毒株的同源性達到99％，只是存在點突變。並且與其他毒株相比，缺失的核苷酸也在同一個位置，不排除為同一毒株的可能。具體的比對結果見圖6。

（7）、與virulent Purdue毒株的序列相比，TGEV H弱毒株與virulent Purdue毒株的同源性為90.99％，virulent Purdue毒株在S基因和ORF3基因之間存在缺失，按照設計的引物擴增的序列可知，2007年前缺失了56個核苷酸，2007年前所知的具體的缺失為：

AATTGAAAAAGTGCACGTCCATTAAATTTAAAATGTTAATTTTATTATCTGCTATAA，不過具體在virulent Purdue毒株在S基因和ORF3基因之間缺失多少核苷酸還有待於進一步的研究。而TGEV H弱毒株則在從ORF3序列的ATG開始的第193位到221位一共缺失了29個核苷酸，具體缺失的核苷酸序列為：

TCAATAGTCATATAGTTGTTTAATATCAT。比對結果見圖7。

試驗例2 《豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用》弱毒株的保護效力試驗

一、試驗材料：

1.華毒株強毒：繫上海市畜牧獸醫研究所1977年12月贈給的第27代小腸毒。我們通過1～2日齡乳豬傳至16代（即華27-16代），1978年3月適應於胎豬腎細胞培養。

2.Miller/10（M）毒株：系1978年11月自匈牙利中央獸醫研究所引進的凍乾毒。啟封后，部分直接接種於FPK細胞並傳代，作為M株細胞毒用於毒株間對比試驗及製備診斷用高免血清；另一部分接種1～2日齡乳豬傳代，作為M株強毒用於互動免疫試驗。

3.日本TGE弱毒疫苗TO163陽性血清及螢光抗體均系日本農林省家畜衛生試驗場於1980年3月和7月贈給。疫苗毒經FPK細胞增至1-2代用於免疫試驗；陽性血清及螢光抗體用於培育弱毒株的定性鑑定試驗。

二、試驗方法

1、免疫試驗

試驗母豬為血清中和試驗陰性的1～2產母豬（個別的為3產）。

主動免疫試驗：使用3日齡哺乳仔豬，口服2毫升傳代毒，經7～10天安全性觀察後，攻擊強毒，做主動免疫試驗。

被動免疫試驗：妊娠母豬產前15天即15天左右先以肌肉、後以鼻內接種5毫升傳代毒。於每次接毒前、產仔當日、攻毒前及觀察結束時，采母豬血清測中和抗體效價。仔豬生後3日齡時攻擊強毒測定被動免疫保護率。

主動免疫攻毒劑量為20個ID50，被動免疫攻毒劑量為100個ID50，所用強毒系華毒27～7代至27～16代之間的傳代毒。攻毒途徑為口服。

中和試驗：用固定病毒稀釋血清的方法在FPK及豬腎傳代細胞IBRS2上進行，指示毒為華株細胞毒及M株細胞毒，劑量為100～1000TCID50/0.3毫升，陽性對照血清為M株高免血清。被檢血清滅活後，做2n連續稀釋。在對照系統完全成立時，以抑制指示毒CPE作用的血清最高稀釋度的倒數為該血清的中和抗體效價。

三、試驗結果

1華毒株傳代毒的克隆化

在165代過程中，進行的五批克隆純化（92、110、116、130及145代）。除首批選過2毫米斑外，均選1毫米斑，前兩批各連續選三次，每次選6～27個單斑混合（稱群體斑）傳代。從116代開始選一個1毫米以內的單斑（稱單體斑）傳代。每隔5代左右進行一次斑徑的檢測，檢測中發現有5～10％的2毫米或更大的空斑出現時，則進行再次純化。克隆化前後的傳代華毒株對三日齡仔豬主動免疫的安全性不同，克隆純化前對仔豬的發病率為83.3％，死亡率40％，選群體斑純化後對仔豬的發病率為23.1％，無死亡。從116代後選斑以後，仔豬的發病率明顯的降低（為5.7％），無死亡（見表1）；被動免疫的保護率也有所提高（見表2）。

表1 克降化前後的華弱毒株與TO163毒株對3日齡哺育仔豬主動免疫對比試驗

表1

表2 華弱毒株與TO163毒株被動免疫比較試驗

表2 華弱毒株與TO163毒株被動免疫比較試驗

2不同接種途徑對中和抗體效價的影響

首先對60頭後備豬（體重70～80斤）分鼻內、肌肉、口服三種途徑各接種102代毒3毫升，267天內進行4次中和抗體跟蹤檢測，證明以鼻內途徑接種豬的中和抗體價最高；第一次檢測口服途徑高於肌肉途徑，但第二、三次肌肉途徑明顯高於口服途徑的抗體效價（圖8-A）。

為驗證試驗的可重複性，又對25頭後備豬接種135代毒（1毫升）跟蹤檢測，三種途徑的比較結果同首次一致，因第二次接種劑量小，故中和抗體效價低（圖8-B）。

試驗結果表明，以純化株經鼻內、肌肉途徑免疫妊娠母豬，其中和抗體效價較高（見表2）。

另外，還表明首次弱毒接種跟蹤檢測結果，中和抗體效價最長可持續13個月，尤以鼻內途徑持續最長，在弱毒接種後9個月時仍達100％陽性，而肌肉接種為50％，口服僅22.2％。

3主動免疫試驗

測定對3日齡哺乳仔豬的安全性是檢查TGE弱毒株安全性的一個重要指標。接種後觀察7～10天做攻毒試驗，以檢測對仔豬的主動免疫情況。傳代毒第92代以前的安全性很差，發病率為83.3％，死亡率為40％，但對耐過的豬攻毒則有88.2％的保護率；92代克隆化（選群體斑）後（102代）發病率降為23.1％，無死亡，攻毒後100％保護。116代克隆純化（選單斑）之後，發病率降低到5.7％，無死亡。135～160代總計免疫110頭仔豬，只有4頭髮病（3.6％），其中2頭死亡（1.8％）。在相同條件下，與日本TGE TO163對仔豬安全性的試驗結果相比雖不如TO163（見表1、3），但作為弱毒株使用是可以的。

表3 華弱毒株135～160代對3日齡哺乳仔豬主動免疫試驗

表3 華弱毒株135～160代對3日齡哺乳仔豬主動免疫試驗

豬傳染性胃腸炎華毒弱毒疫苗株及其套用