表達式載體就是在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件(如啟動子、RBS、終止子等),使目的基因能夠表達的載體。如表達式載體pKK223-3是一個具有典型表達結構的大腸桿菌表達式載體。其基本骨架為來自pBR322和pUC的質粒複製起點和氨苄青黴素抗性基因。
在表達元件中,有一個雜合tac強啟動子和終止子,在啟動子下游有RBS位點(如果利用這個位點,要求與ATG之間間隔5-13bp),其後的多克隆位點可裝載要表達的目標基因。常用細菌質粒進行構建,構建過程中運用限制性核酸內切酶切割出與目的基因相合的末端(多為黏性末端,也有平末端),採用DNA連線酶連線,導入生物體實現表達。