《蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用》是南京工業大學於2009年1月21日申請的專利，該專利的申請號為2009100283207，公布號為CN101473853，授權公布日為2009年7月8日，發明人是胡永紅、管珺、楊文革、沈飛、李棟芸、於輝，該發明屬於生防製劑領域，具體涉及一種蠟樣芽孢桿菌在農業領域的套用。
《蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用》公開了蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用，特別是在農作物的促生及抑菌方面的套用，如提高種子發芽率方面、在促進農作物生長方面以及在抑制病原菌方面。Bacillus cereusCMCC63305同時具有促生和抑菌功能，該菌的多種功效決定了其推廣具有廣泛性，符合生態農業的要求。
2013年，《蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用》獲得第八屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用
- 公布號：CN101473853
- 公布日：2009年7月8日
- 申請號：2009100283207
- 申請日：2009年1月21日
- 申請人：南京工業大學
- 地址：江蘇省南京市新模範馬路5號
- 發明人：胡永紅、管珺、楊文革、沈飛、李棟芸、於輝
- Int.Cl.：A01N63/02（2006.01）I、A01P21/00（2006.01）I、A01P3/00（2006.01）I
- 代理機構：南京天華專利代理有限責任公司
- 代理人：徐冬濤
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
截至2009年1月，資源和生態問題已成為世界各國尤其是中國這樣一個農業大國可持續發展的最主要瓶頸。在農村經濟發展中，化肥、農藥的過量和不當使用以及產品本身結構造成的污染正成為農業環境污染中的一個突出問題，不僅對農村及城鎮生態環境影響巨大，而且嚴重威脅著人類的食物安全和健康。
在2009年1月前社會形勢下，化肥、農藥不可能也不應該從市場上消失，從長遠發展來看，抓緊益生菌的研發工作拔劍弩張。能夠取代化肥和農藥的微生物肥料劑既包括直接提供養分的傳統肥料範疇，又包括促生、拮抗病原微生物、提高植物抵禦不良環境和減少化肥農藥使用量等效應的範疇，對促進作物增產、作物生物災害預防、生態可持續控制、無污染無公害的綠色食品生產及農民負擔的減輕有著不可估量的套用價值。在這一大背景下，研發高效、環保的生防製劑對我國農業的可持續發展意義重大。
很多蠟樣芽孢桿菌是一些穀類作物、蔬菜及樹木的內生菌，能在植物活體內定植，對寄主植物不產生任何危害並與其建立和諧關係，促進植物生長、減少病害蟲害，提高植物抵禦不良環境的能力並減少化肥使用量。除了抑菌和促進植物生長外，部分蠟樣芽孢桿菌還具有抑菌殺蟲作用。這些有益菌常被製成製劑套用於農業，2009年1月前生產上使用的增產菌株83-10、A-47、M22等均為蠟樣芽孢桿菌。CN1417325A提供一種蠟狀芽孢桿菌B.C.98-I的菌種及以該菌株製備微生物殺菌劑的生產方法，該菌株對黃瓜、青椒等蔬菜枯萎病有抑制作用。
發明內容
專利目的
《蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用》的目的是提供一種蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域，特別是提高種子發芽率、促進農作物生長及抑制病原菌方面的套用。
技術方案
《蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用》的目的可以通過以下措施達到：
蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用，特別是在農作物的促生或抑菌方面的套用，如提高種子發芽率方面、在促進農作物生長方面以及在抑制病原菌方面。
蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305菌株的培養方法，包括菌種活化、種子培養和發酵培養步驟。
菌種活化時的培養基為（克/升）：牛肉膏4.0～6.0，蛋白腖7.0～11.0，瓊脂10～30，NaCl4.5～5.5，pH6.0～9.0，其餘為H2O；進一步優選為：牛肉膏4.5～5.5，蛋白腖9.0～11.0，瓊脂10～30，NaCl4.5～5.5，pH6.0～9.0，其餘為H2O，121℃滅菌。菌種活化時，將菌種接入有菌種活化培養基的平板中，30～40℃培養24 。
種子培養時的培養基為（克/升）：牛肉膏4.0～6.0，蛋白腖7.0～11.0，NaCl4.5～5.5，pH6.0～9.0，其餘為H2O。種子培養採用一般的工藝條件，而實驗室的小試方法為：於平板取一環單菌落，接入裝有100毫升培養基的500毫升三角瓶中，在迴轉式恆溫調速搖瓶櫃中以150～200轉/分鐘，30～40℃培養24小時。
發酵培養基中，碳源選自葡萄糖、澱粉或玉米澱粉中的一種或幾種；氮源選自牛肉膏、蛋白腖、酵母膏或尿素中的一種或幾種；無機鹽選自NaCl、MnSO4·H2O、KH2PO4或MgSO4·7H2O中的一種或幾種。發酵培養基優選為（克/升）：牛肉膏4.0～6.0，蛋白腖7.0～11.0，NaCl4.5～5.5，葡萄糖5～20，MnSO4·H2O0.8～1.5，KH2PO41.5～2.5，MgSO4·7H2O0.4～0.6，pH6.0～9.0，其餘為H2O。發酵培養採用常規的發酵培養方法，實驗室的小試方法為：以10％接種量將種子培養液接入裝有100毫升發酵培養基的500毫升三角瓶中，在迴轉式恆溫調速搖瓶櫃中以150～200轉/分鐘，30～40℃培養24小時。
Bacillus cereusCMCC63305菌株用發酵培養基於30～40℃、170轉/分鐘下 培養24小時後即為菌株代謝液。取一定量發酵液於10000轉/分鐘下離心10分鐘，棄上清夜，取菌泥，用無菌水即可製成10cfu/毫升的菌懸液。《蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用》中可以採用1:100～1:1000倍稀釋（10～10cfu/毫升）的菌株代謝液或菌懸液。菌株在培養過程中還可加入某些保護劑以提高發酵的效率。
改善效果
權利要求
1.蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）CMCC63305在提高種子發芽率方面的套用。
2.蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）CMCC63305在促進農作物生長方面的套用。
3.蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）CMCC63305在抑制小麥紋枯病或蔬菜灰霉病方面的套用。
實施方式
操作內容
菌株的培養
種子活化：將Bacillus cereusCMCC63305菌種接入有①號培養基的平板中，37℃培養24小時。種子培養：於平板取一環單菌落，接入裝有100毫升②號培養基的500毫升三角瓶中，在迴轉式恆溫調速搖瓶櫃中以170轉/分鐘，37℃培養24小時。發酵培養：以10％接種量將種子培養液接入裝有100毫升③號培養基的500毫升三角瓶中，在迴轉式恆溫調速搖瓶櫃中以170轉/分鐘，37℃培養24小時。
其中，①號培養基（克/升）：牛肉膏4.0～6.0，蛋白腖7.0～11.0，瓊脂10～30，NaCl4.5～5.5，其餘為H2O，pH6.0～9.0，121℃滅菌。②號培養基（克/升）：牛肉膏4.0～6.0，蛋白腖7.0～11.0，NaCl4.5～5.5，其餘為H2O，pH6.0～9.0，121℃滅菌。③號培養基（克/升）：牛肉膏4.0～6.0，蛋白腖7.0～11.0，NaCl4.5～5.5，葡萄糖5～20，MnSO4·H2O0.8～1.5，KH2PO41.5～2.5，MgSO4·7H2O0.4～0.6，其餘為H2O，pH6.0～9.0，121℃滅菌。
實施案例
實施例1：Bacillus cereusCMCC63305菌株平皿促種子發芽實驗
將濾紙墊於培養皿中，經121℃濕熱滅菌20分鐘，即得到無菌濾紙平皿。Bacillus cereusCMCC63305菌株用發酵培養基於37℃、170轉/分鐘下培養24小時後即得到菌株代謝液，用無菌水稀釋至濃度為10cfu/毫升。挑選顆粒飽和、大小一致的小麥種子，用1％次氯酸鈉表面消毒10分鐘，然後用無菌水衝去麥粒表面殘留的次氯酸鈉並吹乾表面的水分。用濃度為10cfu/毫升的代謝液和在此基礎上稀釋的梯度稀釋液（1:10～1:10000）（10～10cfu/毫升）浸種24小時，以無菌水和未接菌株的培養液作為對照。把小麥種子沿培養皿周圍整齊的播種到培養皿中（每皿33粒，每個處理重複3次），播種時使種子胚一律朝向同一方向，加蓋後，將培養置於恆溫培養箱，定時觀察種子萌發情況，培養66小時後測量根長、芽長及發芽率。結果表明，1:100～1:1000倍稀釋（10～10cfu/毫升）的菌液可將種子的萌發率提高6％～11％，並可顯著促進根生長，增幅達7％～11％。
處理 | 20小時萌芽率/% | 66小時發芽率/% | 根長/厘米 | 芽長/厘米 | 根/芽 |
10cfu/毫升 | 56 | 85 | 2.71 | 1.65 | 1.64 |
1:10 | 76 | 86 | 3.12 | 1.89 | 1.65 |
1:100 | 84 | 88 | 3.68 | 1.97 | 1.87 |
1:200 | 86 | 88 | 3.70 | 1.94 | 1.91 |
1:500 | 89 | 89 | 3.71 | 2.01 | 1.85 |
1:1000 | 85 | 89 | 3.69 | 1.94 | 1.90 |
1:10000 | 84 | 90 | 3.70 | 2.05 | 1.80 |
無菌水 | 78 | 87 | 3.35 | 2.01 | 1.67 |
培養液 | 76 | 88 | 3.34 | 2.08 | 1.61 |
按上述方法，採用濃度為10cfu/毫升的菌株代謝液分別對大豆、水稻、蘿蔔、黃瓜和菠菜進行促種子發芽實驗，結果表明，可分別將種子的萌發率提高5％～7％、9％～12％、6％～8％、6％～9％、4％～6％。
實施例2：Bacillus cereusCMCC63305菌株對農作物促生作用的田間試驗
Bacillus cereusCMCC63305菌株用發酵培養基於37℃、170轉/分鐘下培養24小時後即為菌株代謝液。取一定量發酵液於10000轉/分鐘下離心10分鐘，棄上清夜，取菌泥，用無菌水即可製成10cfu/毫升的菌懸液。田間實驗共設6個不同的處理（編號1，2，3，4，6，7）1個對照（編號5），如表1所示。
編號 | 處理方式 |
5 | CK |
1 | 代謝液浸種（24小時） |
2 | 代謝液浸種（24小時）+灌根（2葉一心） |
6 | 代謝液浸種（24小時）+灌根（2葉一心）+噴灑葉面（3葉一心） |
4 | 菌懸液浸種（24小時） |
3 | 菌懸液浸種（24小時）+灌根（2葉一心） |
7 | 菌懸液浸種（24小時）+灌根（2葉一心）+噴灑葉面（3葉一心） |
每小區長7m，寬3m，2次重複。用常規的栽培方式進行肥水管理。40d後，採樣測量株高、乾鮮重，每個小區採樣50株。Bacillus cereusCMCC63305的6個處理都能增加小麥植株乾重和鮮重，與對照相比，鮮重增加了9％～13％，乾重增加了9％～13％。Bacillus cereusCMCC63305處理後，小麥株高除編號2與編號6處理與對照相當外，其他幾個處理的小麥株高與對照相比都略有增加，增加幅度為2％～6％。經過Bacillus cereusCMCC63305的處理過的小麥都較對照明顯健壯。
按上述方法處理玉米和油菜，都較對照明顯健壯，其鮮重和乾重的增加均在7％～16％以內；將上述方法的時間改為20d後，處理冬瓜和白菜，也都較對照明顯健壯，其鮮重和乾重的增加均在5％～11％以內。
實施例3：Bacillus cereusCMCC63305菌株對農作物苗的促生作用
菌懸液的製備同實施示例2；用菌懸液將清水浸泡和催芽的種子進行拌種，播種於裝有無菌的營養土的花盆中。以清水浸泡未拌種處理的種子作對照。每處理6盆，重複3次。每盆播種5粒，置於培養室中，光暗時間12小時/12小時條件下培養，出苗後每盆留苗4株。待苗的第一片真葉展開後，統計苗成活率、株高、株重。
經拌種處理的黃瓜苗的苗成活率、平均株高、株重都顯著高於清水處理的黃瓜苗，說明Bacillus cereusCMCC63305對黃瓜苗的生長具有促進作用；經拌種處理的黃瓜苗長勢良好，苗整齊粗壯，而對照組同等條件下的黃瓜苗矮小，整體長勢較差。經計算，黃瓜的植株乾重增加了12.5％，根重增加了10.2％。
採用相同的方法處理南瓜、菠菜、蘿蔔、番茄和白菜，其整體長勢都優於對照組。
實施例4：Bacillus cereusCMCC63305菌株對病原菌的平板抑制作用
對照試劑多菌靈用0.02mol/L的稀HCl溶解，配製成母液，再根據劑量加入到培養基中，搖勻，製成含藥平板；腐霉利原藥用丙酮溶解後配製成1000μg/毫升的母液，根據劑量加入到培養基中，搖勻，製成含藥平板。含蠟樣芽孢桿菌培養基的配製：把蠟樣芽孢桿菌培養液按1∶100的比例加入冷卻至40℃左右的培養基中，搖動後倒入9厘米的培養皿中，冷凝後備用。
分別在上述3種培養皿中央接種直徑0.5厘米病原菌的菌碟，菌絲朝下。25℃培養至空白對照菌落布滿培養皿2/3以上時，測量各處理的菌落直徑。每個菌落按十字交叉法測量3次，以其平均數代表菌落的大小。計算藥劑對菌體生長的抑制率。
以多菌靈和腐霉利作為空白對照，進行Bacillus cereusCMCC63305對不同病原菌的平板抑制實驗。未離心的Bacillus cereusCMCC63305代謝液對小麥紋枯病有很好的抑制效果，在10cfu/毫升劑量下對小麥紋枯病的菌絲生長抑制率達86％，略低於多菌靈藥劑的殺菌效果。離心的Bacillus cereusCMCC63305對蔬菜灰霉病的抑制率為51％，接近對照藥劑腐霉利的抑制率51.53％，未離心的Bacillus cereusCMCC63305對蔬菜灰霉病的抑制率為64％，高於照藥劑腐霉利的抑制率52％。
結論：Bacillus cereusCMCC63305同時具有促生和抑菌功能，該菌的多種功效決定了其推廣具有廣泛性，符合生態農業的要求。
榮譽表彰
2013年，《蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農業領域的套用》獲得第八屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
