蛋白質測序

概念介紹

當前，所謂蛋白質測序，主要指的是蛋白質的一級結構的測定。蛋白質的一級結構(Primary structure)包括組成蛋白質的多肽鏈數目。很多場合多肽和蛋白質可以等同使用。多肽鏈的胺基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。

蛋白質胺基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現在已經知道約十萬個不同蛋白質的一級結構。

●1 樣品必需純（>97%以上）；

●2 知道蛋白質的分子量；

●3 知道蛋白質由幾個亞基組成；

●4 測定蛋白質的胺基酸組成；並根據分子量計算每種胺基酸的個數。

●5 測定水解液中的氨量，計算醯胺的含量。

●1肽鏈的拆開和分離

●2測定蛋白質分子中多肽鏈的數目

●3二硫鍵的斷裂

●4測定每條多肽鏈的胺基酸組成，並計算出胺基酸成分的分子比

●5N端、C端的測定

●6多肽鏈斷裂

●7測定每個肽段的胺基酸順序。

●8確定肽段在多肽鏈中的次序。

●9確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。

●常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應時間約20小時。

●此法的優點是不容易引起水解產物的消旋化。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；

●含有羥基的胺基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬(天冬)醯胺和谷氨醯胺側鏈的醯胺基被水解成了羧基。

●一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。

●由於水解過程中許多胺基酸都受到不同程度的破壞，產率不高。部分的水解產物發生消旋化。

●該法的優點是色氨酸在水解中不受破壞。

●目前用於蛋白質肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。

●套用酶水解多肽不會破壞胺基酸，也不會發生消旋化。水解的產物為較小的肽段。

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈藉助非共價鍵連線在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).

2 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端胺基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關係，即可確定多肽鏈的數目。

3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然後用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。