蛋白質自動測序儀

蛋白質自動測序儀是檢測蛋白質一級結構的自動化儀器，是獲得蛋白質一級結構物信息的重要手段，在蛋白質的分子結構與功能研究中占有非常重要的地位。

基本介紹

• 中文名：蛋白質自動測序儀
• 外文名：Automatic Protein Sequencer
• 分類名稱：分子生物學分析設備
• 管理類別：Ⅲ/Ⅱ類

發展歷史

1953年，瑞典化學家Edman採用異硫氰酸苯酯法測定蛋白質的N端序列，為胺基酸自動測序奠定了基礎。

1967年，Edman和Begg根據異硫氰酸苯酯法測定原理設計了第一台蛋白質自動測序儀（旋轉杯蛋白質測序儀），為蛋白質自動測序以及蛋白質自動測序儀的商品化生產提供了理論支持和樣機。

1971年，美國波士頓大學 Laursen博士首先設計出固相蛋白質測序儀。

1981年，R.M. Hewick等人研製了氣相蛋白質測序儀（氣液固相測序儀）。

1986年，美因套用生物系統公司(AB1)出了脈衝式液相蛋白質測序儀。

20世紀80年代發展起來的質譜技術與蛋白質測序儀聯用已經成為對小量肽和蛋白質進行測序的有效工具。

基本結構

1. 蛋白質自動測序儀結構非常複雜，基本組成構件包括反應器、轉換器、進樣器、胺基酸分析系統和信息軟體處理系統。
   
2. 反應器反應器中進行 Edman化學降解反應中偶聯反應和環化裂解反應。在偶聯反應之前有一個樣品固定過程，即將蛋白質樣品固定在纖維板上或將轉印有蛋白質斑點的聚偏二氟乙烯膜（FVDF）放置在反應器中，反應條件要求一定的溫度、時間、液體流量等，由計算機系統自動調節控制這些因素：在反應器中蛋日質成多肽經過偶聯和環化裂解反應形成ATZ衍生物。
   
3. 轉換器ATZ衍生物在轉換器中經有機溶劑（如氯丁烷）抽提出來，再經25%TFA溶液作用轉換成穩定的PTH胺基酸。
   
4. 進樣器 PTH胺基酸由有機溶劑（如乙腈）溶解後經進樣器注入HPLC。
   
5. 胺基酸分析系統 通常由高效液相色譜毛細管色譜柱組成，色譜柱分離是整個測序過程中最為關鍵的一步。影響色諧柱分離結果的因素有液體分配速度、溫度、電壓、電流等。因此，儀器配有穩壓、穩流、自動分配流速裝置。各種胺基酸通過這一系統會產生自己的特徵吸收峰。
   
6. 信息軟體處理系統 由計算機主機完成：記錄和顯示數據，根據胺基酸的層析蜂來判斷為何種胺基酸。它提供測序需要運行的參數：時間、溫度、電壓及其他循環狀況，並可實現跳躍和暫停步驟。
   

以上為蛋白質自動測序儀的主要部件，在此之外還有蛋白質或多肽的純化處理配件及整個測序過程必備的試劑和溶液。

工作原理

蛋白質測序儀主要檢測的是蛋白質一級結構（胺基酸序列），其基本原理沿用艾德蒙（Edman）化學降解法，這也是經典的蛋白質測序方法。利用 Edman化學降解法測定蛋白質或多肽N末端序列，在測定過程中，胺基酸殘基依次與異硫氰酸苯酯（PITC）作用，從蛋白質N末端依次切割下來，形成穩定的PTH胺基酸後進行分析和鑑定。Edman降解進行蛋白質與多肽序列分析是一個循環式的化學反應過程，包括偶聯、裂解、轉化三個主要步驟：

1. 偶聯
   在弱鹼條件下，蛋白質或多肽鏈N末端殘基與PITC偶聯反應生成PTC-多肽。這一反應在45-48℃進行約15分鐘，並用過量的試劑使有機反應完全。
   
2. 環化裂解
   在無水三氟醋酸（TFA）的作用下，可使靠近PTC基的胺基酸環化，肽鏈斷裂形成噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物和一個失去末端胺基酸的剩餘多肽。剩餘多肽鏈可以進行下一次及後續的降解循環。
   
3. 轉化 ATZ衍生物經25%TFA處理轉化為穩定的乙內醯苯硫脲胺基酸（PTH-胺基酸）。
   每個循環反應從蛋白質或多肽裂解一個胺基酸殘基，同時暴露出新的游離的胺基酸開始進行下一個 Edman化學降解反應，最後通過轉移的PTH-胺基酸鑑定實現蛋白質序列的測定。
   

使用方法

蛋白質自動測序儀的常規操作流程如下圖：

操作流程

日常維護

1. 流動相的選擇
   採用與檢測器相匹配且黏度小的“HPLC”級溶劑，經過蒸餾和0.45μm的過濾去除纖維毛和未溶解的機械顆粒等，經過0.2μm的過濾可除去有紫外吸收的雜質對試樣有適宜的溶解度。避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑。
   
2. 水的等級
   需用純化水，因為不純物的存在會增加去離子的吸光率，而純化水中卻去除了無機及有機污染物。裝水的溶劑瓶要經常更換，連續幾天不使用儀器時，要將管路用甲醇清洗。
   
3. 脫氣
   除去流動相中溶解或因混合而產生的氣泡稱為脫氣。因為氣泡會對測定結果產生一定的影響：泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積；柱中氣泡使流動相繞流而使峰變形；檢測器中出現氣泡則使基線產生波動。因此，脫氣可防止由氣泡產生而引起的故障；可防止由溶解氣體量的變動引起的檢測不穩定度。
   
4. 分析柱
   在使用新柱或長時間未用的分析柱之前，最好用強溶劑在低流量下（0.2~3ml/min）沖洗30分鐘；定期使用強溶劑沖洗柱子；使用緩衝鹽後，先用水沖洗4小時左右，再換有機溶劑（如甲醇）沖洗色譜柱和管路；淨化樣品；分離條件合適；不使用時蓋上蓋子，避免固定相干枯；使用預柱；避免流動相組成及極性的劇烈變化；避免壓力脈衝的劇烈變化。
   
5. 燈管
   氘燈不能夠頻繁開啟，否則容易損壞。
   

常見故障分析

故障現象	故障原因	處理辦法
管路中不斷有氣泡生成	吸濾頭堵塞	用5%~20%的稀硝酸超音波清洗，再用蒸餾水清洗
泵無法洗液或排液，流路不通	寶石球黏附於墊片	用針筒抽出口單向閥以產生負壓，使寶石球與墊片分開; 拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超音波清洗
系統壓力波動大	寶石球或塑膠片受污導緻密封不好	拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超音波清洗
系統壓力波動大或漏液	密封圈磨損而導緻密封不良	更換密封圈
系統壓力波動大或壓力偏高	線路過濾器堵塞	5%稀硝酸超音波清洗
漏液	手動進樣閥轉子密封損壞	更換轉子密封
載樣困難	定量環堵塞或進樣器污染	清洗或更換定量環、進樣器
系統高壓、峰型變差、保留時間變化	液相柱污染	正相柱用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇清洗；反相柱用甲醇、乙腈、氯仿、異丙醇、0.05mol/L稀硫酸清洗
樣品池和參比池能量相差較大	檢測器樣品池污染	用針筒注入異丙醇清洗樣品池，如污染嚴重，拆開樣品池，將透鏡等放入異丙醇中超音波清洗