菸草脆裂病毒

是一類套用比較廣泛而且效率和持久性較好的病毒載體，能夠介導基因沉默同時不會帶來病毒誘導的症狀。改造後的病毒能夠促進非病毒序列的插入以及對植物的後續感染，也可以鑑定宿主植物生長點的基因，因此TRV在植物基因功能鑑定中具有廣泛的套用。

基本介紹

• 中文名：菸草脆裂病毒
• 外文名：tobacco rattle virus
• 套用：效率和持久性較好的病毒載體
• 鑑定：鑑定宿主植物生長點的基因
• 分布：歐洲，前蘇聯，日本，紐西蘭

分布

歐洲，前蘇聯，日本，紐西蘭，北美，在中國大豆上報導過，在雲南馬鈴薯田間植株及組培苗中常測到，在田間未見典型症狀，主要分布於東部馬鈴薯產區。如曲靖地區、昭通地區等

寄主植物

是所有植物病毒中寄主範圍最廣的病毒，在50多個雙子葉和單子葉植物的家族中有400多個品種易受該病毒侵染，但在很多寄主上侵染而不引起症狀。

診斷寄主：

莧色藜(Chenopodium amaranticolor)。局部壞死斑在3-5天即可形成，有些有擴散趨勢，絕大多數分離物是局部侵染.

黃瓜 (Cucumis sativus)。褪綠或局部壞死斑，非系統性侵染。

菸草（Nicotiana tabacum cv. Samsun NN）。在接種葉片中典型症狀是壞死斑或壞死環，以及系統性的扭曲和壞死，然而，症狀也同時受到環境條件的影響，一些病株產生症狀或根本就不產生症狀。

法國菜豆（Phaseolus vulgaris）。針狀，2-4天可形成局部壞死斑，非系統性侵染。

Pisum sativum (pea) and Vicia faba (broad bean)。小的局部壞死斑，非系統性侵染。

繁殖寄主：

克利夫蘭煙（Nicotiana clevelandii）,系統性侵染品種，是保存病株和提純病毒最好的材料。

分析寄主：

莧色藜（Chenopodium amaranticolor）和法國菜豆（Phaseolus vulgaris）的初生葉適合局部分析，矮牽牛，普通煙、白肋煙和黃瓜是非常有用的測試介體傳播的誘鉺植物，這些植物的侵染通常是由分析根的提取物的侵染性決定的。

危害情況

感染50多個科中的多種植物。系統感染菸草(Nicotiana tabaccum)、毛葉煙(N. sylvestris)、德勃納依煙(N. debneyi)、長春花(Vinca rosea)和翠菊(Callistephus chinensis)，均引起壞死斑。局部感染豇豆(Vigna sinensis)、黃瓜(Cucumis sativus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、莧色藜(Chenopodium amaranticolor)和茴藜(C. quinoa)等，引起壞死斑。診斷寄主為莧色藜、黃瓜、克利夫蘭煙(Nicotiana elevelandii)和菜豆。汁液、種子或菟絲子傳播。介體為11種毛刺線蟲(Trichodorum spp.)，能保毒20個星期 。致死溫度80-85℃，稀釋終點10-6，體外保毒期幾個月。紫外輻射能不可逆地鈍化病毒粒子。分3個血清型毒株：歐洲毒株、脆裂毒株和美洲毒株，並附有一個缺蛋白的不穩定毒株。也有分PRN株（典型株）CAM株（辣椒環斑）、加州株和俄勒岡株。某些病毒抗血清效價達1/1000，它與豌豆早褐病毒（pea early browning virus）有遠緣的血清學關係。得率20-100毫克/升病汁液。病毒的形成與高爾基體有關，並位於線粒體表面，呈輻射狀。在寄主根和莖的生長點細胞中也有病毒。在寄主細胞質中，能觀察到由異常線狀粒體組成的大型X體內含體。

主要病症：在馬鈴薯塊莖中引起壞死弧,在莖中引起斑駁（扭曲，矮化和斑駁，通常局限於由感染的塊莖而產生的一個或幾個嫩枝），和花芽的黃斑，在馬鈴薯葉中形成，在馬鈴薯中很少有系統侵染，因此，許多因侵染而傷的馬鈴薯塊可以產生無毒的後代植株，許多雜草在自然條件下易受侵染，尤其是他們的根，但是一些可以系統侵染，它們中的某些品種諸如看不出有什麼明顯的症狀。

形態特徵

形態與組分

桿狀，185-197×20-25納米，根據分離株的不同，還有78-114×20-25納米的粒子。螺旋對稱，螺距2.55納米，每一螺旋周期 有25.33個蛋白亞基，空心直徑5納米。粒子分子量72700000，或報導 5000000（179-192納米粒子）、29500000，或報導 12000000-29000000（73-77納米粒子）；沉降係數299S（187納米粒子）、173 S（55納米粒子）、155 S（46納米粒子）。等電點pH4.0-4.5，電泳遷移率-1.7×10-5厘米2/秒.伏（pH7.0的0.06摩爾升磷酸鹽緩衝液中），A260/A280=1.15, A260 3.0 。 核酸為RNA，含量5%，分子量2300000-270000（長粒子）、550000-1500000（短粒子），沉降係數26S（175-190納米長的粒子）(在內含0.01摩爾/升Tris,0.01摩爾/升KCl的0.0001摩爾/升MgCl2的pH7.4的緩衝液中)，其中2種RNA有600個相同的核苷酸排列順序，這些不處於3’端的核苷酸順序可能是核糖體、衣殼蛋白或複製酶的識別點。核酸3’端末尾順序為GCCCOH.引起寄主發病的症狀基因分別分布在2條核苷酸上同，G∶A∶C∶U=25.5∶16.7∶28.9∶28.8（全部粒子的組分）、25.5∶16.3∶29.3∶28.9(下層粒子)、24.3∶17.0∶29.0∶29.8(中層粒子)、25.4∶15.8∶29.8∶29.1(上層粒子)．蛋白質含量95%,蛋白亞基分子量23800,胺基酸殘基數218個.

生物學

症狀：

儘管有許多症狀的描述，但在試驗植物中，仍然沒有可以靠症狀來區分的植物，事實上，靠症狀來區分的變種，常常能從大量的栽培中分離出來。這最好的有特點的品種是：

PRN，首先在英國獲得，現在已發展成為典型株，它的短顆粒長78nm。

SYM，首先在英國的菠菜上獲得，在可引起扭曲和壞死，除非使用低濃度的接種物，它的短顆粒101nm長。

義大利6號，首先從種植在義大利的菸草秧苗上獲得，在血清學上與豌豆早褐病毒相關並與1973年由Harrison將其劃分為豌豆早褐病毒，但在1987年時，Robinson又將其劃分為菸草脆裂病毒，它的短顆粒長105nm。

N5。首先從蘇格蘭的水仙上獲得，在上引起嚴重的壞死，甚至導致植株死亡，在血清學上與豌豆早褐病毒的荷蘭血清型 相關，它的短顆粒75nm長。

PSG和TCM。首先在番茄和鬱金香上獲得，，TCM與豌豆早褐病毒的荷蘭血清型相關。

不能產生核蛋白顆粒的分離物依靠使用只含有長顆粒的接種物從上面的任何株系中均能獲得，用只含有長顆粒的接種物，從上面的任何株系中均能獲得不能產生核蛋白顆粒的分離物。用機械接種的方法，它們的傳播能力很差，但很易通過藉助苯酚製備的核酸接種物傳播。與它們的親本M-型培養物相比，它們中的大多數更容易在植物中導致壞死斑，並且轉變為系統侵染的速度也慢。在自然感染的植物中發現有相似的分離物存在。

血清學：

一些菌株有弱的免疫原性，但是含有1‰效價的試管沉澱素的抗血清就可以與其它菌株產生沉澱反應。在試管沉澱試驗中，沉澱物在體細胞和鞭毛之間，免疫吸附電鏡和ELISA(Harrison et al., 1983)是現在最常用的檢測方法。瓊脂雙擴散或瓊脂糖凝膠試驗不敏感。

關係：

菸草脆裂病毒與其它菸草脆裂病毒群有類似的顆粒和基因組特點。事實上，關於菸草脆裂病毒與豌豆早褐病毒(Maat, 1963)和胡椒環斑病毒之間有遠緣的血清學關係已有報導(Harrison & Woods, 1966; Kurppa et al., 1981)。但是在用菸草脆裂病毒RNA-1做探針的雜交試驗中(Robinson & Harrison, 1985a; Robinson et al., 1987),這些病毒並不與其發生反應，也不與菸草脆裂病毒形成假重組子(Frost et al., 1967; Lister, 1968; Robinson & Harrison, 1985b).。菸草脆裂病毒有許多血清型存在(Harrison & Woods, 1966; Robinson & Harrison, 1985a)，並且不同血清型中的成員之間只存在遠緣的血清學關係。也有證明表明在血清型中存在血清學的變化。然而所有的分離物在核酸雜交試驗中都與RNA-1探針互動反應(Robinson & Harrison, 1985a; Robinson et al., 1987)，與RNA-1和RNA-2的重組體的假重組分離物很容易產生(Harrison & Robinson, 1986)，一些菌株，諸如義大利6號和5號，與豇豆早褐病毒的兩種血清型中的一種與兩種有很近的血清學關係，但是根據它們與RNA-1探針的雜交試驗和假重組試驗，將它們劃分為菸草脆裂病毒(Robinson et al., 1987).。

汁液穩定性：

在克利夫蘭煙(N. clevelandii)汁液中，M型分離物的熱失活點（10分鐘） 是80-85度，稀釋終點是10-5-10-6，侵染力在20度時可達6星期以上，-20度時可達許多年。相反，NM型分離物當汁液加熱至50度時10分鐘，稀釋至10-1，在20度達1小時，或在-20度保存，就失去侵染能力(Cadman & Harrison, 1959; Cadman, 1962)。

基因組特徵：

株系SYM 的RNA -1(Hamilton et al., 1987), PSG的RNA -2(Cornelissen et al., 1986)以及TCM 的RNA -2 (Angenent et al., 1986)的核苷酸序列都已搞清， 5'可能帽子化(Pelham, 1979), 3'有含有假結的類似tRNA的次級結構(Van Belkum et al., 1987)，然沒有探測到胺基酸接受器活性 ，也沒有基因組連結蛋白或聚腺苷醯化序列。

RNA-1在植物中能獨立複製和系統傳播。它含有菸草屬的局部斑和系統侵染的決定因子(Cadman & Harrison, 1959; S?nger, 1969)，含有4種開放閱讀框，編碼（從5' end）：一個134K的蛋白，該蛋白由一蛋白因子終止；一個194K蛋白，該蛋白是通過該終止子的通讀而產生的；並且它含有與公認的菸草花葉病毒複製酶同源的序列；一個29K蛋白，它含有與公認的菸草花葉病毒的30K的轉運蛋白同源的序列(Boccara et al., 1986)；以及一個未知功能的16K的蛋白。

RNA-2含有能引起莧色藜系統症狀的遺傳決定因子(Kurppa et al., 1981)，和菸草的黃花葉病(Lister & Bracker, 1969),以及特定的血清(S?nger, 1969).並且它編碼外殼蛋白。在RNA-1和

RNA-2的兩端有同源的序列，但是兩個株系的同源程度因株系而異；有些株系僅3' end的同源區就大的足以包括RNA-1的16 K 和29 K的部分和全部開放閱讀框(Cornelissen et al., 1986; Robinson et al., 1987)。株系TCM的RNA-2在外殼蛋白和3' end的同源區含有額外的開放閱讀框，它編碼29K蛋白，該蛋白與編碼RNA-1的蛋白沒有同源性(Angenent et al., 1986)。在體外和推測在體內，這134 K 和 194 K蛋白是由RNA-1翻譯來的(Fritsch et al., 1977)，然而29 K, 16 K和外殼蛋白卻是由亞基因組RNA的1a, 1b and和2a,分別翻譯來的

與細胞和組織的關係：

絕大部分入侵的組織變得容易感染，在克蘭夫煙的葉絨毛細胞中，絕大部分由異常線粒體組成的‘X-小體’ 能由PRN誘導產生，但僅能維持幾天。在‘X-小體’和細胞質中存在一些病毒粒子的聚集體(Harrison et al., 1970)。

傳播途徑

在歐洲、北美或日本的Paratrichodorus和Trichodorus屬中，至少有7種線蟲是其自然傳播介體。有跡象表明，病毒株系與介體品種之間存在特異性。成蟲和若蟲可以傳毒，但是，介體蛻變可能不能保存病毒。通過線蟲或接種的方法均可在1小時獲得病毒，並可由非飼養的線蟲保持數月。有人認為，病毒顆粒粘附到介體的食管壁上，當線蟲進食時連同唾液一起被分泌到根細胞。但是沒有病毒在介體內增殖的證據，因此，病毒可能不能通過線蟲的卵傳播。

雜草：在Viola arvensis中傳毒的效率接近10%，在其它一些雜草中傳毒的頻率更低（Cooper & Harrison, 1973. ）。

菟絲子：至少有6種菟絲子可以傳播。病毒可以感染菟絲子(Schmelzer, 1956).)。

檢疫與防治

生態和控制

菸草脆裂病毒本質上是一種雜草和野生植物病毒(Noordam, 1956; Cooper & Harrison, 1973(Cooper, 1971)),它在土壤中的分布反映了它的介體是喜歡輕的沙質壤土壤，還是泥煤土壤。在一塊地中它或許可成塊狀分布。防治方法包括殺線蟲和nematostatic。化學試劑使用，抗性品種和無病毒原料的種植(Harrison & Robinson, 1986)。

菸草脆裂病毒由於它特有的粒子、在診斷寄主上的症狀以及產生NM分離物的特點，表明它與其它病毒組顯著不同，CAM和別的南美的分離物，起初被劃分為菸草脆裂病毒血清型III, 而現在則被認為是辣椒環斑病毒的分離物(Robinson & Harrison, 1985a)。辣椒環斑病毒最多與菸草脆裂病毒有遠緣的血清學關係 ，並且在RNA-1探針的核苷酸雜交試驗中沒有相互反應(Robinson & Harrison, 1985a)。菸草脆裂病毒能與豌豆早褐病毒相區分，通過前者不能系統侵染豌豆和菜豆，在菜豆上產生精確枯斑，以及RNA-1探針的核酸雜交試驗。菸草脆裂病毒的M型分離物有時能通過血清學試驗鑑別出來，除非不同株系間抗血清的巨大差別在該試驗中所產生的陰性結果 。然而所有的M型分離物都可以通過RNA-1探針的核酸雜交試驗探測到(Robinson & Harrison, 1985a; Robinso n et al., 1987)。NM型分離物在RNA-1探針的雜交試驗中能被鑑別出來，或增加S粒子或RNA-2到該培養物中以產生M型分離物(Harrison & Robinson, 1982)。

主要參考文獻

1 Anderson, Phytopathology 44: 87, 1954.

2 Angenent, Linthorst, Van Belkum, Cornelissen & Bol, Nucleic Acids Res. 14: 4673, 1986.

3 Ayala & Allen, J. agric. Univ. P. Rico 52: 101, 1968.

4 Bailiss & Okonkwo, J. hort. Sci. 54: 289, 1979.

5 Behrens, Landwn VersStnen 52: 422, 1899.