一般認為莖尖分生組織中(包括原套、原體等)，維管系統尚未發育完善，病毒僅能通過剛形成的少量的胞間連絲進行細胞間轉移，且多數病毒還需藉助運動蛋白(MP)對胞間連絲進行修飾方能容病毒核酸通過。因此莖尖分生區的病毒傳播速度很慢，組培後獲得無毒苗的幾率也較大。
基本介紹
- 中文名：莖尖脫毒
- 屬於：在植物體內分布是不均一的
- 包含：病毒濃度越稀
- 技術關鍵：母體植株的選擇和預處理
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脫毒依據
病毒在植物體內分布是不均一的，越接近生長點約（0.1-1mm區域），病毒濃度越稀，因此有可能採用小的莖尖離體培養而脫除植物病毒。
技術關鍵
（1）被脫毒植物攜帶病毒的診斷及其在體內的分布
再脫毒之前，應了解植物攜帶何種病毒，病毒在體內的分布位置，以確定培養莖尖的大小
（2）母體植株的選擇和預處理
母體的選擇：
欲脫毒材料的品種典型性：關係到脫毒以後的脫毒苗是否保持原品種的特徵特性
植體健康程度選擇：應選感病輕、帶毒量少的健康植株作為脫毒的外植體材料，這樣更容易獲得脫毒株。
外植體預處理：
（3）莖尖的剝離
在剝取莖尖時，把莖芽置於解剖鏡下（8~40倍），一隻手用鑷子將其按住，另一隻手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常常蘸入90%酒精，並用火焰灼燒以進行消毒。但要注意解剖針的冷卻，可蘸入無菌水進行冷卻。當一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之後，用解剖刀片將分生組織切下來，為了提高成活率，可帶1-2枚幼葉，然後將其接到培養基上。接種時確保微莖尖不與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。剝離莖尖時，應儘快接種，莖尖暴露的時間應當越短越好，以防莖尖變乾。可在一個襯有無菌濕濾紙的培養皿內進行操作，有助於防止莖尖變乾。
將接種好的莖尖置於25℃左右的溫度下。每天以16小時 2000-3000lx的光照條件下培養。由於在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數月才能成功。
繼代培養得到足夠的檢測苗、進行病毒檢測。
（4）脫毒效果檢測
A 指示植物鑑定(indicator test plants) 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專化性症狀的寄主植物。
每種病毒都有自己敏感的植物，例如：
馬鈴薯病毒的敏感植物有千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼佗羅
大麗花病毒的敏感植物為：矮牽牛、黃瓜、莧色蘺
菊花病毒：矮牽牛、豇豆
指示植物鑑定病毒的方法
a.摩擦接種法：
取培養植株的葉片置於研缽中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸緩衝液（pH 7.0），磨成勻獎，將其塗抹在指示植株葉片上，在指示植物的葉片撒上金剛砂，通過輕輕摩擦使汁浸入葉片表皮細胞而又不損傷葉片。5分鐘後用清水清洗葉面。將指示植株放於防蚜蟲網罩的溫室內。然後視其病斑的有無，來判斷是否脫除了病毒。
例如：植物液接種後如使千日紅葉片枯斑，黃花煙、心葉煙呈花葉，證明該植物體內具有馬鈴薯X病毒
b、嫁接法
有些病毒不是通過汁液傳播，而是通過專門的介體傳播的，例如草莓黃花病毒、草莓叢枝病毒是通過一種特殊的蚜蟲為介體進行傳播的。這種病毒的鑑定，需將培養植株的芽嫁接在敏感植物上，根據敏感植株的病症來判斷是否脫除了病毒
B 血清鑑定(serologic test) 試管沉澱反應；免疫雙擴散；酶聯免疫吸附測定(ELISA)。
a、試管沉澱反應
在抗原-抗體最適比例的條件下，觀察有無沉澱的產生來確定被測植株是否帶病毒。試管沉澱反應操作簡單，需注意的問題：
①、葉綠體的自發凝聚
可用磷酸緩衝液提取汁液，再用氯仿處理除去葉綠體，pH 保持在6.5-8.5）
② 、抗原抗體的比例要適當，當抗原過量時回抑制沉澱的形成
b、免疫雙擴散
在半固體凝膠中測定在其中擴散的抗原和抗體間的沉澱反應的方法。與沉澱法比較起來有兩個優點：一是節約血清，二是汁液不用特殊處理。
步驟：
①倒膠，一般厚2mm
②打孔，多打成梅花型
③加樣，加血清和汁液。
一般加樣後在37℃恆溫過夜，即可進行結果觀察。有擴散沉澱的即為帶毒株，沒有則為不帶毒株
c、酶連免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）
它是將抗原、抗體的免役反應和酶的高效催化反應有機結合起來的一種綜合性技術。即通過化學的方法將酶與抗體或抗原結合起來，形成酶標記物。然後將它與相應的抗原或抗體起反應，形成酶標記的免疫複合物。結合在免疫複合物的酶，在遇到相應的底物時，催化無色底物生成有色底物，通過比色計可以準確測定。優點是靈敏度高，測定快速，每次可以同時測定多個樣品。
C 電鏡檢查法
採用電子顯微鏡，可直接觀察樣品材料有無病毒存在，還可以進一步鑑定病毒顆粒大小、形狀和結構，這些特徵相當穩定，因此電鏡檢查法既準確又有效，但需要有一定的設備和技術。
D 分子檢測法
例如RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reation）將待測的樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進行反應，合成cDNA，然後利用病毒DNA特有的序列設計引物進行PCR反應，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表達
n 脫毒苗的離體保存與繁殖:一般是在實驗室進行，一般每月繼代一次，可以在培養基中加入生長延緩劑，如B9和矮壯劑可2-3個月繼代一次，也可放到液氮或4℃冰櫃中保存
n 建立脫毒種苗生產繁殖網路體系：如果試管苗生產成本過高或移栽困難，可將試管苗選擇種植在一定的控制區域，從繁殖技術和環境隔離上保證較高水平，使得繁殖的種苗能有效的防止病毒的再侵染
（5） 影響脫毒效果的因素
① 母體材料病毒侵染的程度:單一病毒感染的植株脫毒較容易,而複合浸染的植株脫毒較難
② 外植體的生理狀態:頂芽的脫毒效果比側芽好,生長旺盛的芽比休眠芽或快進入休眠的芽好
③ 起始培養的莖尖大小:不帶葉原基的生長點培養脫毒效果最好,帶1-2個可獲得40%脫毒苗
實例
1.馬鈴薯是用塊莖種植的無性繁殖作物，在生長期間容易被病毒侵染造成 病毒性退化，並常受晚疫病、環腐病、青枯病和黑脛病等多種病害侵襲。所以馬鈴薯雖然是高產作物，但常常並不高產、穩產。特別是病毒性退化，是各地馬鈴薯生產的主要威脅。為了解決這一問題，我國於70 年代引進了馬鈴薯莖尖脫毒技術，80 年代逐漸普及到各省、市、自治區。現在許多研究單位均已掌握了馬鈴薯脫毒苗的生產與快繁技術，脫毒薯正在迅速推廣，並比一般種薯增產30%～50%，甚至一倍以上，很受農民歡迎。同時我國各地在馬鈴薯生產過程中，因地制宜地創造了多種保種技術，如一季作地區的夏播留種；中原二季作地區的陽畦留種和春季早收留種並實行秋播；雲南一些地區的三季薯留種法等。這對防止馬鈴薯種薯的迅速退化和減產都有顯著作用。脫毒薯和留種技術相結合，既能增產，又能延長種薯使用年限。
2.南羅平小黃姜的莖尖脫毒組培快繁
