苯誘導的PKM2對造血細胞內活性氧代謝的影響和意義

《苯誘導的PKM2對造血細胞內活性氧代謝的影響和意義》是依託武漢大學，由畢勇毅擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：苯誘導的PKM2對造血細胞內活性氧代謝的影響和意義
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：畢勇毅
• 依託單位：武漢大學

項目摘要

苯是一種生產性毒物和環境污染物，能夠引起靶細胞產生大量的活性氧（ROS），引起氧化應激和大分子損傷，包括DNA雙鍵斷裂。本課題組既往研究發現，胚胎造血幹細胞對苯毒性的反應較骨髓造血幹細胞更為敏感，這為苯致兒童白血病的發病機制的研究提供了新的思路。最近的研究發現，腫瘤細胞通過抑制M2型丙酮酸激酶（PKM2）的活性，來對抗氧化應激和活性氧簇導致的細胞損傷。基於上述發現，我們假設PKM2在苯致造血細胞ROS產生的生物學效應中起著重要作用。本研究著力於PKM2在胚胎造血幹細胞對抗苯及其代謝產物氧化反應中的作用。通過RNA沉默技術和特異性小分子激活劑調控PKM2活性，觀察造血幹細胞生長增殖和體外集落形成情況，檢測氧化應激中重要的調節因子和酶如Nrf2、GCLM和GSS的mRNA及蛋白水平的表達，細胞周期和凋亡，ROS，γ-H2AX和PKM2的活性。為苯致兒童白血病和造血系統毒性機制的研究提供新的思路

結題摘要

苯是一種職業性毒物和環境污染物，可以誘導細胞產生活性氧（ROS），引起氧化應激和大分子損傷。本研究探索苯及其代謝產物對造血細胞中ROS和PKM2（M2型丙酮酸激酶）誘導的劑效關係；明確在造血細胞中，苯醌（BQ）對抗氧化系統的作用關係；套用抗氧化劑，通過對PKM2的調控拮抗苯的造血毒性，預防苯中毒。實驗中的造血幹細胞為小鼠卵黃囊胚胎造血幹細胞（YS-HSCs）和骨髓造血幹細胞（BM-HSCs）。分離富集YS-HSCs後，用不同濃度BQ處理細胞，DCF-DA染色，流式細胞儀和雷射共聚焦顯微鏡檢測細胞中ROS的產生情況；分別用實時定量螢光聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和蛋白免疫印記法（WB）檢測不同濃度BQ處理後YS-HSCs中PKM2 mRNA和蛋白的表達變化情況；分別提取細胞核蛋白和漿蛋白，檢測Nrf2的核遷移和蛋白水平的表達變化；用WB檢測Nrf2-ARE通路下游的若干蛋白的表達；抗氧化物N-乙醯半胱氨酸（NAC）預處理細胞後檢測ROS在調節PKM2蛋白表達水平方面的作用。分離富集BM-HSCs後，用不同濃度BQ處理細胞，運用RT-PCR和WB檢測細胞中MST1基因的mRNA和蛋白表達；NAC預處理細胞後用BQ染毒，檢測ROS在調節MST1蛋白表達水平的作用。BQ處理YS-HSCs後，細胞內ROS的產生增加，呈劑量反應效應；BQ誘導YS-HSCs中Nrf2的核轉移和Nrf2-ARE通路下游蛋白的表達。BQ處理使PKM2蛋白的表達減少，但所有BQ處理組與對照組相比，PKM2 mRNA的表達沒有統計學差異，這說明BQ可能誘導了PKM2的降解。抗氧化物NAC預處理細胞使ROS的產生減少，並且抑制了BQ對PKM2蛋白的降解作用。BQ處理BM-HSCs後，隨著干預濃度的增加，MST1基因蛋白表達被下調,且以劑量反應形式改變，而其磷酸化水平先升高后降低；NAC預處理後，細胞中ROS的產生減少，NAC抑制了BQ對MST1基因蛋白的下調，磷酸化水平隨著NAC濃度增加而降低。該研究首次發現PKM2在YS-HSCs中被BQ誘導降解，同時伴隨有細胞內ROS的產生增多；抑制ROS產生後PKM2的降解作用被緩解，證實了ROS在BQ誘導的PKM2降解中的作用。本研究對於探討苯及其代謝產物對造血細胞內活性氧代謝的影響具有重要的作用，進而可以深入探討白血病的發病原因和機制。