色素代謝新基因ABCB6的功能研究

《色素代謝新基因ABCB6的功能研究》是依託華中科技大學，由鄧雲華擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：色素代謝新基因ABCB6的功能研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：鄧雲華
• 依託單位：華中科技大學

中文摘要

黑素決定著皮膚類型和顏色，體內合成需經過多步驟酶促生化反應來完成，其間受到複雜而精細的調控，其中源於線粒體的RISP、F1F0 ATP酶及抑制素對色素沉著的調控作用倍受關注，但如何調控線粒體外色素代謝通路的機制迄今仍未明了。ABCB6是我們近期發現的一個參與色素代謝的新基因，主要表達於線粒體外膜。ABCB6是否就是連線線粒體內、外色素代謝通路的橋樑基因亟待驗證。本項目採用分子生物學手段將野生型ABCB6基因、突變型ABCB6基因分別導入黑素細胞以及RNAi抑制黑素細胞ABCB6基因，研究這些細胞內黑素含量、線粒體外相關因子（TRY、TYRP1、OCA2等）及線粒體內相關因子（RISP、F1F0 ATP酶等）表達水平的變化規律；運用酵母雙雜交技術與免疫共沉澱法篩選與ABCB6作用相關蛋白，最後闡明ABCB6的可能作用通路，完善對色素代謝系統的認識。

結題摘要

ABCB6是本課題組基於一個五代泛發性色素異常症家系率先鑑別、與色素代謝相關的新基因。為深入研究其功能，首先成功構建野生型表達質粒pEGFP-ABCB6和突變型ABCB6表達質粒[pEGFP-ABCB6(p.Ser170Gly)]，採用Lipofectamine 2000試劑盒將這些質粒分別轉染鼠B10BR黑素細胞，同時設定B10BR細胞非轉染組和pEGFP空載體轉染組做對照，結果發現：Real-time PCR法檢測四組轉染黑素細胞TYR、TYRP1、OCA2和RISP等黑素代謝相關因子mRNA表達水平差異不甚明顯，Western blot法檢測四組轉染黑素細胞TYR、OCA2和RISP等關鍵因子蛋白表達水平差異不大，NaOH裂解法測定的突變體轉染組B10BR細胞黑素含量略低下。套用RNA干擾（RNAi）技術沉默黑素細胞ABCB6基因表達，其TYR、OCA2和RISP等相關因子mRNA表達水平、蛋白表達水平差異與ABCB6過表達組結果類似。隨後將野生型和突變型pEGFP-ABCB6分別轉入鼠B16細胞，同時加入DAPI和GalT等特異性細胞器標記，採用共聚焦顯微鏡進行亞細胞定位觀察，結果發現：野生型ABCB6均勻分布於細胞核周圍，突變型ABCB6則聚集於高爾基體內。而與黑素代謝相關蛋白分別進行亞細胞共定位研究時發現：TYRP1與突變型ABCB6一起滯留於核周高爾基體，而不能正常定位於黑素小體，提示突變型ABCB6可能幹擾TYRP1的轉運。與TYRP1轉運通路關鍵蛋白分別進行亞細胞共定位觀察，結果發現：野生型和突變型ABCB6均與關鍵蛋白Rab32/38存在共定位。採用免疫共沉澱技術亦證實：ABCB6可與Rab32/38蛋白發生相互作用。最後運用酵母雙雜交技術進行驗證發現：與ABCB6作用相關的靶蛋白就是Rab32/38。這些結果充分表明：ABCB6通過與轉運蛋白Rab32/38相互作用，參與TYRP1在高爾基體的轉運活動，進一步完善了對黑素代謝系統的認識，具有重要的學術價值。