在蛋白質生物合成中，各種胺基酸在參入肽鏈之前必須先經活化，然後再由其特異的tRNA攜帶至核糖體上，才能以mRNA為模板縮合成肽鏈。胺基酸活化後與相應的tRNA結合的反應，均是由特異的氨基醯-tRNA合成酶(amino acyl-tRNA synthetase，簡寫為aaRS)催化完成的。
基本介紹
- 中文名：胺基酸活化與轉運
- 英文名：Amino acid activation and translocation
- 研究時間：1983-1986年
- 同源性：20%─50%
活化反應,tRNA合成酶(aaRS),
活化反應
胺基酸-AMP-aaRS複合物的形成在aaRS、ATP及二價陽離子(如Mg2+)存在下，形成上述複合物並釋放出PPi。例如，丙氨酸-AMP－丙氨醯－tRNA合成酶（AlaRS)複合物的形成如下：氨基醯－tRNA的形成胺基酸以胺基酸－AMP－aaRS複合物的形式轉到tRNAAla上，形成Ala-tRNAAla。各種tRNA的3’端都有同樣的三個核苷酸的序列（-CCA）。胺基酸即結合在tRNA的3’－CCA末端腺苷酸（A）的核糖2’或3’游離－OH上，以酯鍵相連。上述胺基酸的活化反應，表示絕大多數胺基酸的活化過程。到目前為止，另發現有二種胺基酸（GLN和Ile）的活化有其特殊條件。Gln-tRNA複合物的形成如下，即先由一個Glu經GluRS作用接在tRNAGln上，形成Glu-tRNA；然後再經轉氨基酶作用，將Glu（或Asn）的醯胺基接到Glu-tRNA複合物的Glu上，最終形成Gln-tRNA複合物。
此外哺乳動物Ile-tRNA複合物的形成，在標準的tRNA氨基醯化反應系統中(50mmol/LTris-HClpH7.5，50mmol/LK+，2mmol/LMg2+，1mmol/LDTT，2mmol/LATP，aaRS，tRNA和標記的某種胺基酸)，必須加入1-2mmol/L的多胺(如精胺)，否則哺乳動物的tRNAIle不能被氨基醯化。
tRNA合成酶(aaRS)
aaRS存在於所有的生物體，定位於細胞漿。已從許多生物組織中提純，其分子量從2.27×104－2.7×105不等，有的由單一肽鏈組成，有的由幾個亞基組成，通常稱為α和/或β亞基。單個肽鏈的大小差別較大，從嗜熱桿菌(Bacillusstearothermophilus)的TrpRS含327個胺基酸殘基到E.coliIleRS含939個胺基酸殘基不等。來源於不同生物的同種aaRS其序列保守性亦不同，如酵母和細菌的同種aaRS比較，其同源性約在20%─50%範圍。
aaRS的活性中心一般含有一個或幾個-SH基，對該巰基進行化學修飾通常會導致酶失活，從而認為這些巰基在催化中發揮作用。例如，aa-AMP能夠與巰基反應形成巰酯鍵，然後再與tRNA反應。E.coliGlyRS由α2β2四個亞基構成，當用N-甲基縮蘋果醯胺(N-methy1-maleimide)去處理酶的-SH基，會導致GlyRS失活。已證明N-甲基縮蘋果醯胺滅活該酶的靶位置是β亞基的Cys395，以致阻止了aa-AMP與tRNA反應，但不抑制Gly-AMP複合物的形成。然而，並不是所有的半胱氨酸對酶的活性都有關鍵性作用。如GlyRS的β鏈含Cys98，Cys395和Cys450三個半胱氨酸，將這些Cys用Ala取代而形成的突變子，在體內、外均有活性。因為Ala取代幾乎不影響活性。人們認為N-甲基縮蘋果醯胺的作用基礎最可能是空間障礙所致。支持這一論點的證據是:Csy395→Gln395突變後，GlyRS的催化活性可下降10倍。
aaRS的兩個活性(形成aa-AMP複合物和aa-tRNA複合物)在肽鏈內具有較明確的結構域。aaRS的N端序列具有使aa-AMP複合物形成的活性，稱為aaRS的aa-AMP合成結構域，毗鄰aa-AMP合成結構域C端的部分序列具有識別特異tRNA的活性，稱為aaRS的aa-tRNA合成結構域。例如，E.coliAlaRS含四個α亞基，每條肽鏈含875個胺基酸殘基。分析表明，第1-461位胺基酸殘基組成的肽段具有使tRNAAla氨基醯化作用。其中，第1-368位殘基序列屬aa-AMP合成結構域，第369-461位殘基序列是結合tRNAAla的關鍵部位。第699-808位胺基酸殘基段對形成AlaRS四聚體(α4)是重要的。亦有一些研究顯示，aaRS結合tRNA的部位跨越在不同亞基間。據上述，aaRS具有高度的特異性，它至少有兩識別位點，既能識別特異的胺基酸，又能識別攜帶該種胺基酸的特異tRNA分子。在體內，每種aaRS都能從20種胺基酸中精確選擇與其相對應的一種，並識別出與此胺基酸相適應的特異tRNA，即一種胺基酸可被數種不同的同工tRNA攜帶。換言之，aaRS對胺基酸有嚴格的特異性，而對與此胺基酸相適應的數種同工tRNA則無嚴格的特異性
人們之所以對aaRS做了大量研究，主要是對其識別作用具濃厚的興趣。aaRS與相應的tRNA結合併不強，在生理pH，解離常數在0.1-1.0mmol/L範圍。當pH在5-5.5時，氨基醯化反應變慢，但結合力變強，解離常數為1-10nmol/L。相對弱的aaRS-tRNA反應需要的，因為酶在氨基醯化反應需迅速轉變，不能長時間與aa-tRNA形成複合物。1982年，已得到了AspRS-tRNAAsp複合物結晶，這些關鍵區域是胺基酸接受臂，二氫尿嘧啶莖，反密碼子莖和反密碼子。其後有一些實驗肯定了上述結果基本適合於其它aaRS-tRNA的相互結合部位。aaRS對tRNA的識別過程分二步進行:首先是酶與tRNA的初步結合，然後是tRNA的氨基醯化。tRNA分子上的反密碼子對於酶的識別作用是需要的，反密碼子是aaRS識別的主要特徵。然而，反密碼子並不是aaRS識別必需特徵。例如，Leu和Ser各有6個密碼子，這些密碼子可以被帶有不同反密碼子的同工tRNA閱讀。每一種同工tRNALeu或tRNASer僅由一種aaRS所特異地氨基醯化。這說明，反密碼子並非是aaRS識別的首要靶子，至少在這些酶是這樣。
aa-tRNA複合物的形成是非常精確的。aaRS在非常類似的胺基酸之間怎樣進行選擇，過去長時間迷惑不解。後來當發現IleRS如何精確區別Ile和Val後，特別令人鼓舞。Ile和Val僅有單個甲基之差，以致這二種胺基酸與IleRS的結合能之差僅2-3Kcal，這樣小的能差並不能阻止發生錯誤的結合，即阻止IleRS去識別Val。例如，當等克分子的Ile和Val混合併加入IleRS後，可產生10-2的錯誤頻率。但活化的Val與tRNAIle結合率非常低。當tRNA與Val-AMP-IleRS結合成複合物時，幾乎所有的Val-AMP分解為Val和AMP。這樣，在Ile和Val之間的鑑別能夠發生二次，最終的錯誤頻率為10-2×10-2=10-4。現在進一步清楚單通過這些酶的校正是不足以達到足夠精確度。近年來，通過對TyrRS三維結構的研究獲得了對aaRS識別作用的新認識。已證明TyrRS在二個非常類似的胺基酸Phe和Tyr二者之間進行選擇是通過與Tyr的-OH基形成特殊的氫鍵，而不僅僅是通過前述的校正方式。據目前所知，以特殊氫鍵而區別的胺基酸還有Asp，Asn，Cys，His，Lys和Trp。一旦一個特殊的胺基酸被連線到tRNA分子上，在蛋白質合成的後續步驟中便沒有任何特異的識別和校正方式。如當Cys-tRNACys形成後，再修飾為Ala-tRNACys，把後者加入血紅蛋白無細胞合成系統，新合成的Hb肽鏈中的Cys位便均被Ala占居。因此，tRNA是唯一能選擇模板的分子。
近年來(1983-1986年)的免疫學研究顯示，某些心肌炎病人具有直接針對HisRS，ThrRS和AlaRS的自身抗體。在具有AlaRS自身抗體的病人，也有抗tRNAAla抗體。由此提出了這樣的可能性:抗tRNAAla抗體是直接針對AlaRS抗體的獨特型抗體，而抗AlaRS抗體直接針對AlaRS的tRNAAla結合位點，提示tRNAAla結合部位是具有抗原性的。通過X射線結晶學證明酶和aa-AMP之間可能有11個氫鍵，酶的側鏈和主鏈（MC）均涉及到反應。它們的相互作用除氫鍵外，還有VanderWaal力。如果用Phe取代Tyr，則不能形成VanderWaal力相互作用。
