《肺炎支原體生物類群多樣性研究》是依託復旦大學，由劉楊擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：肺炎支原體生物類群多樣性研究
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：劉楊
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
肺炎支原體是重要的呼吸道病原體，但其較小的基因組長度及有限的生物合成能力使肺炎支原體需要非常複雜的培養基添加成份才能在體外生長。由於體外分離培養困難，國內臨床株收集保存有限，既往對臨床分離株的生物學特徵研究很少。通過培養方法改良申請人自2005年起已收集保存肺炎支原體臨床株逾150株。在前期研究基礎上，本研究計畫對肺炎支原體生物類群多樣性進行進一步研究：①種群多樣性：呼吸道感染患者中進一步分離培養肺炎支原體，建立菌種庫，採用多重位點串聯重複序列分析方法進行聚類分析，構建數位化資料庫，了解菌株間的進化關係；②生理類群多樣性：毒力差異；生境適應性研究，採用DNA微陣列技術進行環境應答相關表達譜分析；③遺傳多樣性：臨床分離株P1基因的變異特徵；核糖體寡核苷酸序列差異和抗生素敏感性關係研究。本研究對於明確肺炎支原體類群豐度，闡明其基本生物學特性和遺傳變異規律具有重要意義。
結題摘要
課題組嚴格按照課題計畫書進行，目前已發表SCI文章3篇。主要研究內容有：1. 菌種庫的不斷完善 目前臨床分離株數約250餘株，均進行了藥物敏感性試驗。2. 種群多樣性研究 對152株肺炎支原體採用多重位點可變數目串聯重複序列分析方法（MLVA）進行了分型。152株肺炎支原體共被分為17個MLVA型，而其中137株大環內酯類耐藥肺炎支原體被分為15個MLVA型。以上結果提示中國地區大環內酯類耐藥肺炎支原體的流行來源於多個耐藥克隆。3. 遺傳多樣性研究 建立變性梯度凝膠電泳技術（DGGE）分析134株肺炎支原體臨床分離株的p1基因變異情況，並與PCR-RFLP和測序法比較其在檢測基因變異的作用。DGGE方法結果顯示，共檢測18株新突變株，與p1基因測序結果一致，優於PCR-RFLP的檢測方法（14株）。通過Genbank 序列比對，18株臨床突變株中，8株為MpⅡ型 V2c突變株；2株為MpⅡ型 V2a突變株；7株MpⅠ型臨床株發生了點突變。此外，還發現了一株新型V2型突變株Mp100，其p1基因的序列均不同於Ⅰ、Ⅱ型，與目前報導過亞型和突變型相比也均有很大的差異，根據目前關於Mp臨床突變株的研究，我們將此突變型命名為V2d型突變株。4. 生理類群多樣性研究 本實驗研究利用Real-time PCR顯示在不同亞抑制菌濃度（0, 2, 32 µg/ml）的大環內酯類抗生素作用下，觀察到肺炎支原體肺炎支原體粘附、代謝、毒力相關基因mRNA轉錄水平有顯著變化；同時通過掃描電子顯微鏡觀察到不同的亞抑菌濃度下肺炎支原體形態與生長狀態有變化。5. 針對敏感及耐藥菌株的遺傳多樣性突變特點建立快速檢測方法 採用Cycleave PCR，設計熒螢光探針，特異性擴增耐藥位點，實現快速診斷及耐藥性檢測一步完成。肺炎支原體分離株Cycleave PCR檢測結果：101株肺炎支原體臨床分離株中，19株無突變敏感株、81株A2063G突變耐藥株和1株A2064G突變耐藥株分別出現了與陽性對照pMD-FH、pMD-2063和pMD-2064相同的擴增結果，與常規PCR擴增及測序結果完全相符。採用Cycleave 套用於臨床標本檢測：136份痰液標本中，12份出現與陽性對照pMD-2063相同的擴增結果，其它124份均為陰性結果，也與常規PCR擴增及測序結果完全相符。
