聚酮合成起始單元選擇的分子機制研究

《聚酮合成起始單元選擇的分子機制研究》是依託上海交通大學，由鄭艦艇擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：聚酮合成起始單元選擇的分子機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：鄭艦艇
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

聚酮是由短鏈羧酸連續脫羧聚合而形成的一大類化學結構複雜、生物活性多樣的次級代謝產物，其中許多已經被用作臨床藥物。生物合成研究發現，聚酮合酶（PKS）起始模組中的醯基轉移酶（AT）結構域決定聚酮合成起始單元的選擇，是PKS設計改造的理想靶點之一。在前期的工作中我們解析了一個起始AT的晶體結構，並結合體外功能分析鑑定了一些參與底物結合的關鍵胺基酸，但詳細的分子機制仍不清楚。本研究中我們將對起始AT底物特異性的分子機制進行系統研究：首先，解析起始AT與底物複合物的晶體結構，確定催化中心參與底物結合的關鍵位點；其次利用定點突變和體外功能分析驗證這些關鍵位點胺基酸組成對底物特異性的影響；再次，解析突變體的晶體結構，並與野生型AT進行比較，分析催化中心的結構變化；最後，利用所得到的結果指導起始AT底物特異性的設計改造，將預期的起始單元引入到聚酮的生物合成，在微生物體內合成具有預期化學結構的聚酮產物。

結題摘要

聚酮是一大類結構複雜活性多樣的次級代謝產物，由短鏈羧連續脫羧聚合形成，其中的許多已經被用作臨床藥物。在聚酮生物合成過程中，模組化聚酮合酶（modular polyketide synthases，mPKS）的醯基轉移酶（acyltransferase，AT）結構負責選擇聚酮鏈的起始單元和延伸單元，因此AT是mPKS設計改造的重要靶點。本研究中我們採用了多種方法研究AT結構域底物特異性的分子機制。阿維菌素PKS的起始AT（AveAT0）可以利用2-甲基丁醯輔酶A（Coenzyme A，CoA）和異丁醯CoA兩種起始單元。前期工作中我們解析了AveAT0的晶體結構，基於結構的序列比對幫助我們確定了可能影響底物醯基部分識別的關鍵位點。通過突變AveAT0的醯基結合口袋，我們得到了對2-甲基丁醯輔酶A特異性提高的AveAT0突變體。鹽黴素是具有抗菌和抗球蟲活性的聚醚類聚酮化合物，已經被商業化套用，在畜牧業中作為飼料添加劑。鹽黴素的合成前體包括丙二醯CoA（Malonyl-CoA，MCoA）, 甲基丙二醯CoA（methylmalonyl-CoA，MMCoA），和乙基丙二醯CoA（ethylmalonyl-CoA，EMCoA）。為了理性鹽黴素mPKS中的AT如何區分識別這三種底物，我們解析三種不同AT的晶體結構，利用分子動力學模擬鑑定了參與底物識別的位點，並以此為基礎構建了底物特異性發生轉換的突變體。這些突變體的催化效率接近野生型AT的效率。某些AT識別的底物由醯基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP）而不是CoA攜帶。這些由ACP攜帶的合成前體常常具有特殊的C2位功能基團。在本研究中我們解析氨絲菌素mPKS第三個模組中識別氧甲基丙二醯ACP（methoxymalonyl-ACP，MOMACP）的AT的晶體結構，並進行了體外生化分析。結果顯示這個AT利用底物口袋入口處保守的色氨酸區分底物中的CoA和ACP載體部分，其W275R突變體對ACP和CoA分子的特異性發生轉換。由於MOM-ACP的前體是糖酵解途徑中的D型中間體，人們普遍認為MOM-ACP具有2R構型，AT-MOM複合物晶體結構清楚的顯示該AT利用2S型底物，說明MOM-ACP合成過程中需要一步異構化步驟。這些結果為AT的底物特異性設計改造提供了基礎。