羅氏454測序系統

羅氏 454 測序系統是454 生命科學公司推出的 454測序技術，是基於焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統, 開創了第二代測序技術的先河。該技術是通過合成反應而測序(Seqencing-bysynthesis, SBS)的原理進行測序的。

基本介紹

• 中文名：羅氏454測序系統
• 測試原理：基於焦磷酸測序法
• 特點：依靠生物發光對DNA序列進行檢測
• 測序流程：支持各種不同來源的樣品序列測定
• 套用：植物轉錄組測序

測序原理

GS FLX系統的測序原理是基於焦磷酸測序法，依靠生物發光對DNA序列進行檢測。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶和雙磷酸酶的協同作用下，GS FLX系統將引物上每一個dNTP的聚合與一次螢光信號釋放偶聯起來。通過檢測螢光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術不需要螢光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；具有分析結果快速、準確、高靈敏度和高自動化的特點。

454測序原理

測序流程

1. 樣品種類：GS FLX系統支持各種不同來源的樣品序列測定，包括基因組DNA，PCR產物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同類型的樣品測序都可在一台儀器上完成。

454測序流程

2. 樣品DNA打斷：樣品如基因組DNA或BAC等被打斷成300到800bp的片段；對於小分子的非編碼RNA，這一步驟並不需要。短的PCR產物則可利用GS融合引物擴增後直接進行步驟4。

3. 加接頭：藉助一系列標準的分子生物學技術，將3′端和5′端有特異性的A和B接頭連線到DNA片段上。接頭也將在後繼的純化，擴增和測序步驟中用到。圖中僅僅顯示了後續步驟中要用到的單鏈的DNA片段。

4. 一條DNA片段=一個磁珠：接頭使成百上千條DNA片段分別結合到一個磁珠上，磁珠被單個油水混合小滴包被後，在這個小滴里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響，從而實現了所有DNA片段進行平行擴增（emPCR）。

5. 一個磁珠=一條讀長：經過emPCR擴增後，每個磁珠上的DNA片段擁有了成千上萬個相同的拷貝。經過富集以後，這些片段仍然和磁珠結合在一起，隨後就可以放入到Pico Titer Plate板中供後繼測序使用了。

6. 數據讀取和分析工具：GS FLX

系統提供三種不同的生物信息學工具對測序數據進行分析，適用於不同的套用。例如多達3Gb序列的重測序，對比已知參考序列進行的擴增產物差異分析及120Mb的從頭測序工作等。

羅氏454測序系統是最早出現的新一代測序系統，其套用成果在Nature，Science上發表了多篇論文。454系統自推出以來進行了多次升級，最新的GS FLX序列分析儀的配合Titanium系列測序試劑具有更高的測序通量（400Mb每反應），具有更加廣泛的靈活性和準確性，並且保持了新一代測序技術中運行速度最快（3-5天）和最高單序列讀長（400bp）的優勢，而且單一讀長的準確性可以超過99.5%，完整測序結果一致準確性大於99.99%。Titanium系列中的新成員，長距離Paired-End試劑盒更能對長達3-20kb的插入片段進行雙端測序，突破了新一代測序技術對重複序列較差的瓶頸。此外，具備完整的軟體包是GS FLX的一大特色，其簡單易用的圖形界面，可以用來進行作圖、拼接和擴增產物差異檢測等研究。同時GS FLX因為其超高的測序讀長，可以和傳統的序列分析軟體相互接軌，也是其他新一代測序技術所不能實現的。正因為其優異的性能，GS FLX 系統可以廣泛套用在全基因組de novo測序和BAC文庫重測序、擴增產物重測序、轉錄組分析、基因調節的研究等基因組學研究中。

TBC服務內容

（一）全基因組de novo測序

（二）轉錄組測序

（三）全基因組或基因組區域重測序

（四）擴增產物重測序

（五）宏基因組測序

TBC服務承諾

每個樣本提供15倍以上的454測序數據；

全基因組精細圖達到全基因組覆蓋度大於95%，基因區覆蓋度達到98%以上；

完成圖得到完整全基因組序列，無片段錯拼和遺漏，單鹼基錯誤率低於十萬分之一；

基因組一次成型計畫：原核基因組單獨使用454測序，達到全基因組少於10個scaffolds，無片段錯拼和遺漏；

超高通量、高效率、高重複性、高準確率、低成本、完備的生物信息分析。

套用

利用454測序系統測序植物轉錄組,可以得到大量的表達序列標籤(Expressedsequencetag,EST)。EST是cDNA的一個片段,通常長度在150~400bp之間。研究人員可以通過連線兩端有相同序列的EST,獲得一個contig,直至全長cDNA序列。通過對這些EST序列與已知資料庫進行生物信息學分析比較,可以進行如下研究。

1新基因發現與物種基因文庫的構建

2 SNP 發現以及分子標記篩選

3 轉錄圖譜的繪製

4 代謝途徑的確定

5 在分子進化研究領域的套用

6 在 sRNA 發現和功能驗證領域的套用