454轉錄組

454轉錄組是使用羅氏454高通量測序技術進行轉錄組研究的方法。

套用範圍和優點

適用於 對於沒有獲得全基因組序列的物種的轉錄組進行研究。優點是可以得到大量的EST長序列。

技術流程

文庫構建→→油包水PCR→→454測序

流程說明

文庫構建

1) 液氮保存新鮮的組織樣品，提取高質量的總RNA;

2) 使用Oligo d(T)柱子純化mRNA；

3) 改進的3’Primer逆轉錄合成cDNA（SMART方法）;

改進的3’Primer（加入BsgI酶切位點）為：

5'- ATT CTA GAG GCC GAG GC gtgcag d(T)18 VN -3'

(N=A,G,C,or T;V=A,G,or C)

4) BsgI酶切去除PolyA；

5) 雙鏈cDNA片段化；

6) 連線454特有的A & B接頭;

7) 使用磁珠篩選去除接頭自連片段;

8) 片段篩選，保留一端是A接頭、一端是B接頭的片段;

9) 氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA文庫。

 油包水PCR (Emulsion PCR)

1) DNA片段和捕獲磁珠混合;

2) 礦物油和水相的劇烈震蕩產生油包水環境;

3) DNA片段在油包水環境中擴增;

4) 破油並富集有效擴增磁珠。

454 測序

1) PTP準備和清洗;

2) 富集磁珠塗布於PTP;

3) 塗布其他反應成分和包埋磁珠;

4) PTP置於儀器開始測序。