維生素B12輸入體蛋白BtuCD的構象變化和轉運機理研究

《維生素B12輸入體蛋白BtuCD的構象變化和轉運機理研究》是依託復旦大學，由王文寧擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：維生素B12輸入體蛋白BtuCD的構象變化和轉運機理研究
• 依託單位：復旦大學
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王文寧

項目摘要

ATP結合模組（ATP-binding cassette,ABC）轉運體家族蛋白負責主動輸運物質進出細胞膜，參與細胞的諸多重要生理過程，也是臨床治療中細菌和癌細胞抗藥性的主要來源。維生素B12轉運體蛋白BtuCD是ABC轉運體家族轉運機理研究的典型體系，本項目計畫運用分子動力學模擬方法在原子水平上研究BtuCD膜蛋白構象變化的熱力學和動力學，闡明底物轉運機制。主要採用metadynamics等增強抽樣方法計算BtuCD四個不同構象之間沿特定途徑轉換的自由能變化曲線（面），得到轉運循環中構象變化的完整圖像。研究底物結合蛋白BtuF和核苷酸分子對BtuCD構象變化的影響，澄清二者對BtuCD轉運循環的調控作用。通過計算轉運循環中關鍵蛋白構象和底物結合的自由能，闡明構象變化和底物轉運的關係。分析底物轉運機制中的關鍵胺基酸殘基，通過設計突變進行實驗驗證，深入揭示底物轉運的分子機制。

結題摘要

ATP-結合模組（ATP-binding cassette, ABC）轉運體家族蛋白負責主動輸運物質進出細胞膜，參與細胞的諸多重要生理過程，也是臨床治療中細菌和癌細胞抗藥性的主要來源。本項目運用分子動力學模擬，增強採樣算法和馬爾科夫態模型分析等計算方法研究了維生素B12轉運體蛋白BtuCD-F及同家族的ABC轉運體蛋白的構象動力學和底物轉運的分子機理。在BtuCD的孔道閉合狀態，模擬發現底物維生素B12與孔道沒有特異性的相互作用，在通道細胞外側的門徑關閉是防止底物回流的關鍵。底物在孔道中的位置與細胞內側門徑的打開程度具有相關性。在對BtuCD後水解體系的模擬中發現，ATP水解導致核苷結合模組結構域NBD二聚體的非對稱打開，L-loop在 NBD 與跨膜區的構象變化耦合中扮演了重要的角色。模擬結果也顯示底物的轉運是慢速過程，與最新的實驗結果吻合。我們通過大規模分子動力學模擬結合馬爾科夫態模型分析，發現BtuF在底物結合前後均有很高的構象柔性，補償底物結合的熵損失，BtuF的底物結合機制不符合底物結合蛋白的經典捕蠅草結合模型。通過增強採樣的metadynamics模擬，考察了MBP激活麥芽糖輸入體MalFGK2水解活性的機制。通過構象變化的自由能面計算，我們發現MBP的結合明顯改變輸入體蛋白構象變化的自由能面構造，使得半打開構象更加穩定，兩個核苷結合模組結構域互相靠近，從而促進水解反應的發生。這一研究定量地揭示了底物結合蛋白對轉運體構象變化的調控以及水解活性增強機制，同時也解釋了不同實驗數據之間的矛盾。最後，我們結合分子動力學模擬，馬爾科夫態模型分析，核磁共振和單分子螢光共振能量轉移等實驗方法研究了ABC轉運體家族底物結合蛋白GlnBP的構象動力學。核磁共振殘餘偶極耦合實驗數據與分子動力學模擬的四個構象組成的系綜模型相吻合，其中晶體結構之前發現的“打開”和“關閉”狀態只是該系綜的兩種主要構象。綜上所述，本項目的研究揭示了BtuCD及其家族類似蛋白的構象動力學和底物轉運機制，而且發展了結合多種技術的方法，可廣泛用於蛋白質構象動力學性質的研究。