《結核分枝桿菌MazG功能研究及其與無毒株H37Ra毒力丟失的關係》是依託復旦大學，由趙國屏擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：結核分枝桿菌MazG功能研究及其與無毒株H37Ra毒力丟失的關係
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：趙國屏
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
結核分枝桿菌無毒株H37Ra與致病株H37Rv源自共同的祖先臨床株H37。我們通過H37Ra全基因組測序及相關的比較基因組研究，發現H37Ra MazG高度保守區段的A219突變為E；根據H37Ra產生的過程及大腸桿菌MazG與細菌的休眠和在不利生長條件下的存活能力相關的表型，提出該突變為最初突變，且與細胞生長相關，亦有可能與體內生存相關的假說。體外實驗表明該突變導致MazG的焦磷酸水解酶活性降為野生型蛋白的5%，另外我們發現恥垢分枝桿菌MazG缺失突變株的菌落形態與H37Ra尤為相似。本研究擬利用生物化學，分子生物學技術，在生化、細菌表型與整體模型等層次對結核分枝桿菌MazG開展研究，探索該突變導致酶活顯著降低的分子機制，闡明結核分枝桿菌MazG的生理功能，揭示該基因突變與H37Ra特有表型，特別是與體內外持續生長中的特性的關係，探索相關的作用機理；為結核病防治提供新的研究思路。
結題摘要
我們通過比較基因組研究發現了Mycobacterium tuberculosis (Mt)無毒株H37Ra MazG的A219E突變。我們提出該突變與H37Ra在細胞以及體內生存能力下降相關的假說，並開展了本研究工作。MazG屬於dNTP焦磷酸水解酶蛋白家族，能夠將dNTP類物質水解為dNMP和焦磷酸。我們研究發現Mt MazG不但能夠水解正常的(d)NTP, 還有降解具有致突變作用的dUTP 和 8-oxo-dGTP的能力，而MazG[A219E]則喪失了該水解能力，為一個功能喪失突變體。MazG被敲除的Mycobacterium smegmatis (Ms) 菌株在雙氧水處理下的存活能力比野生株顯著下降，同時MazG的氧化應答效應與其dNTP焦磷酸水解能力有關。感染Mt的巨噬細胞可產生活性氧（ROS）及活性氮（RNS），ROS和RNS可氧化游離的核苷酸。我們認為MazG 蛋白能夠降解特定的氧化損傷型dNTP, 從而防止其摻入DNA導致錯配和突變的發生。實驗發現，mazG缺失的Msm在氧化條件和穩定生長期下的抗利福平自發突變頻率明顯高於野生菌株；通過對抗性菌株rpoB 基因的測序發現，mazG缺失菌株的C-T突變頻率明顯高於野生菌株，提示MazG的真正底物應該能夠導致C-T 突變的發生，如5-OH-dCTP和5-CHO-dUTP等。我們對這些氧化型dNTP進行了酶促動力學常數測定。Mt MazG 對5-OH-dCTP的Km值為1.9 µM。化學遺傳學實驗結果顯示，向mazG缺失菌株轉化5-OH-dCTP後其突變頻率顯著上升，同時表現出劑量依賴效應，而野生株突變頻率則無變化，說明5-OH-dCTP為MazG的真正底物。隨後，我們在細胞模型和小鼠模型上研究了MazG與結核分枝桿菌毒力的關係。感染激活的小鼠巨噬細胞系RAW264.7後，mazG缺失的Mt的存活能力低於野生菌株。在小鼠模型上，mazG與Mt持續感染有關：感染小鼠28天之後，缺失mazG的Mt在小鼠脾臟中的存活能力比野生株低1個log單位，肺臟的病理損傷程度顯著低於野生株，說明MazG與Mt的體記憶體活和毒力有關。該研究不但發現了一個新的參與抑制C-T突變的housecleaning相關蛋白MazG，同時揭示了Mt維持其基因組穩定性與體內生存的新機制。
