《精編蛋白質科學實驗指南》是2007年科學出版社出版的圖書，作者是(美)J. E. 科林根(Coligan， J.E.)。
基本介紹
- 中文名：精編蛋白質科學實驗指南
- 作者：(美)J. E. 科林根(Coligan， J.E.)
- 出版時間：2007年1月
- 出版社：科學出版社
- ISBN：9787030180865
內容簡介,圖書目錄,
內容簡介
本書介紹了蛋白質製備、檢測和分析的傳統方法，並對最常用的技術，如層析和電泳，進行了詳細介紹。
圖書目錄
譯者的話
前言
參編者
推薦的背景讀物
第1章 蛋白質純化和定性的策略
1.1單元 蛋白質純化和定性概述
目標和研究對象
蛋白質純化的原料
蛋白質的檢測和分析
蛋白質分離和純化方法
蛋白質產物的定性
蛋白質純化實驗室
1.2單元 蛋白質純化流程圖
可溶性重組蛋白
不可溶性重組蛋白
可溶性非重組蛋白
膜相關的和不可溶性重組蛋白
第2章 計算分析
2.1單元用於蛋白質序列分析的疏水分布圖
方法學
套用
結論
2.2單元 蛋白質二級結構預測
二級結構預測的方法
二級結構預測方法的套用
2.3單元 使用BLAST程式家族進行序列相似性搜尋
進入BLAST程式和文檔
BLAST介紹
BLAST程式
2.4單元 網際網路上的蛋白質資料庫
蛋白質結構資料庫
蛋白質家族資料庫
2.5單元 蛋白質三級結構預測
同源性建模
序列分布圖法
執行緒法
從頭結構預測
2.6單元 蛋白質三級結構建模
辭彙
進入SwissModel程式和文檔
ExPDB資料庫
創建首次法建模查詢的格式
觀看SwissModel結果
2.7單元 比較蛋白質結構預測
比較建模的步驟
第3章 檢測和分析方法
3.1單元 分光光度法確定蛋白質濃度
基本方案1 計算一個蛋白質的摩爾吸收係數
基本方案2 摺疊蛋白質摩爾吸收係數的測定
基本方案3 使用摩爾吸收係數通過吸收光譜測定蛋白質的濃度
基本方案3 使用摩爾吸收係數通過吸收光譜測定蛋白質的濃度
基本方案5 粗蛋白質提取液總蛋白質濃度的測定
3.2單元 定量胺基酸分析
樣品製備
平均組成的計算
3.3單元 肽和蛋白質的體外放射標記
基本方案1 使用碘珠對酪氨酸或組氨酸殘基進行碘化
備擇方案1 用氯胺T或Iodogen在酪氨酸或組氨酸殘基碘化
備擇方案2 使用乳酸過氧化物酶在酪氨酸或組氨酸殘基碘化
輔助方案1 等摩爾碘化以獲得產物的高收率
輔助方案2 用HPLC從碘化產物中分離未標記的肽
基本方案2 用Bolton Hunter試劑在賴氨酸殘基或N端碘化
基本方案3 通過酸酐乙醯化在賴氨酸殘基或N端進行14C或3H標記
備擇方案3 通過還原性烷基化在賴氨酸殘基或N端進行14C或3H標記
備擇方案4 用碘乙酸或碘乙醯胺在賴氨酸殘基進行14C或3H標記
基本方案4 在肽合成過程中引入標記的胺基酸殘基
備擇方案5 在肽合成過程中在N端進行選擇性標記
3.4單元 總蛋白質的分析
基本方案1 總蛋白質定量的雙縮脲分析
基本方案2 總蛋白質定量的Hartree Lowry分析
基本方案3 總蛋白質定量的二喹啉甲酸(BCA)分析
基本方案4 總蛋白質定量的酸消化--茚三酮法
輔助方案1 熱封玻璃管
基本方案5 測量總蛋白質的考馬斯染料結合分析(Bradford分析)
輔助方案2 蛋白質樣品的凝膠透析
輔助方案3 蛋白質樣品的三氯醋酸沉澱
3.5單元 溶液中和細胞表面上蛋白質的生物素化
基本方案1 將生物素共價連線到賴氨酸上
基本方案2 將生物素共價連線到巰基上
輔助方案1 二硫鍵的還原
輔助方案2 生物素化蛋白質的檢測
3.6單元 用胺基酸進行代謝標記
基本方案 用35S甲硫氨酸對懸浮細胞進行脈衝標記
備擇方案1 用35S甲硫氨酸對貼壁細胞進行脈衝標記
備擇方案2 用35S甲硫氨酸對細胞進行脈衝追蹤標記
備擇方案3 用35S甲硫氨酸對細胞進行長期標記
輔助方案 用TCA沉澱確定標記摻入
第4章 提取、穩定和濃縮
4.1單元 用透析和超濾法脫鹽、濃縮和更換緩衝液
基本方案1 用再生纖維素透析袋進行脫鹽、濃縮和更換緩衝液
基本方案2 用不對稱圓盤膜超濾進行濃縮或透析
備擇方案1 用切向流超濾進行滲濾或濃縮
備擇方案2 用離心式超濾器進行微量濃縮和脫鹽
4.2單元 蛋白質的選擇性沉澱
策略設計
基本方案1 用鹽析選擇性沉澱
備擇方案1 用分步鹽析選擇性沉澱
基本方案2 用等離子沉澱選擇性沉澱：柱法
備擇方案2 用等離子沉澱選擇性沉澱：透析法
基本方案3 使用C4和C5有機共溶劑選擇性沉澱
基本方案4 使用蛋白質排阻和擁擠劑及滲透物選擇性沉澱
基本方案5 使用合成的和半合成的聚合電解質選擇性沉澱
基本方案6使用金屬和多酚雜多陰離子選擇性沉澱
4.3單元 蛋白質的長期保存
蛋白質聚集
化學降解
在不凍的水溶液中保存
以鹽析沉澱物的形式保存
以凍結溶液的形式保存
以凍乾固體的形式保存
選擇適當的保存方法
蛋白酶的抑制
第5章 重組蛋白的生產
5.1單元 在大腸桿菌中生產重組蛋白
5.2單元 大腸桿菌表達系統的選擇
基本方案1 在pL啟動子控制下的表達：溫度誘導
基本方案2 在trp啟動子控制下的表達：化學誘導
備擇方案1 在lac/tac啟動子控制下的表達
備擇方案2 T7RNA聚合酶/啟動子表達系統
輔助方案1 菌株保存
輔助方案2 SDS PAGE分析樣品的製備
輔助方案3 可溶性分析
輔助方案4 周質提取物的製備
輔助方案5 細胞外培養基樣品的製備
5.3單元 最適宜於蛋白質生產的大腸桿菌的發酵和生長
基本方案以分批發酵的方式生產重組蛋白
備擇方案1 用重金屬衍生物進行重組蛋白的體內標記
備擇方案2 重組蛋白的穩定同位素標記
輔助方案1 監測生長
輔助方案2 檢查無菌度
5.4單元 在桿狀病毒系統中的蛋白質表達
基本方案1 病毒貯液的大規模生產
基本方案2 表達動力學的確定
基本方案3 在生物反應器中生產
備擇方案 用灌注培養生產
輔助方案 收穫
5.5單元 用於生產外源蛋白質的酵母培養
基本方案1 使用釀酒酵母半乳糖調控的載體小規模表達
備擇方案1 使用葡萄糖阻抑型ADH2載體表達
備擇方案2 使用帶糖酵解基因啟動子的載體表達
基本方案2 在巴斯德畢赤酵母中小規模表達
輔助方案 蛋白質提取物的小規模製備
5.6單元 哺乳動物細胞蛋白質表達的概況
5.7單元 在哺乳動物細胞中生產重組蛋白
基本方案1 用鹼裂解/陰離子交換捕獲法純化質粒
基本方案2 用脂質體轉染法轉染細胞
基本方案3 用遺傳黴素（G418）進行新黴素磷酸轉移酶(NPT II)的選擇
輔助方案 對G418背景敏感性的確定
基本方案4 用氨甲蝶呤（MTX）擴增二氫葉酸還原酶(DHFR)
基本方案5 通過多次傳代使懸浮細胞適應生產培養基
基本方案6 細胞在大規模轉瓶中以分批的方式生長
基本方案7 細胞在大規模分批反應器中的生長
備擇方案 在生物反應器中連續培養細胞的生長
基本方案8 從轉瓶培養物和大規模反應器中收穫分泌的產物
基本方案9 從轉瓶培養物的大規模反應器中收穫與細胞相關的產物
5.8單元 細胞培養物和痘病毒貯液的製備
基本方案1 單層細胞的培養
基本方案2 懸浮細胞的培養
基本方案3 痘病毒貯液的製備
5.9單元 重組痘病毒的構建
基本方案1 用痘病毒載體轉染痘病毒感染的細胞
基本方案2 重組病毒噬斑的選擇和篩選
基本方案3 噬斑的擴增
5.1.0單元 細胞蛋白質表達系統的選擇
5.1.1單元 使用Gateway系統在多種宿主中進行蛋白質表達
第6章 重組蛋白的純化
6.1單元 在大腸桿菌中生產的重組蛋白的純化概述
確定溶解度
蛋白質定位
分離可溶性蛋白質
分離不可溶性蛋白質
6.2單元 從大腸桿菌中製備可溶性蛋白質
基本方案 在大腸桿菌中可溶性表達的一種蛋白質：白細胞介素1β的純化
6.3單元 從大腸桿菌中製備和提取不溶性(包含體)蛋白質
基本方案1 從大腸桿菌中製備和提取不溶性(包含體)蛋白質
基本方案2 在鹽酸胍存在的情況下進行中壓凝膠過濾層析
6.4單元 蛋白質摺疊概述
蛋白質是怎樣摺疊的
怎樣摺疊蛋白質
6.5單元 大腸桿菌不溶性（包含體）蛋白質的摺疊和純化
基本方案1 牛生長激素的摺疊和純化
基本方案2 人白細胞介素2的摺疊和純化
基本方案3 帶組氨酸標籤蛋白質的摺疊和純化：HIV1整合酶
6.6單元 GST融合蛋白的表達和純化
基本方案1 谷胱甘肽S轉移酶融合蛋白的表達
基本方案2 可溶性GST融合蛋白的親和層析純化
備擇方案 用親和層析從包含體中純化GST融合蛋白
基本方案3 蛋白酶切割融合蛋白溶液以除去GST親和標籤
6.7單元 硫氧還蛋白融合蛋白的表達和純化
基本方案 硫氧還蛋白融合蛋白的構建和表達
輔助方案 硫氧還蛋白融合蛋白的滲透壓釋放
第7章 重組蛋白的定性
7.1單元 重組蛋白定性概述
7.2單元 用紫外吸收光譜法測定重組蛋白的一致性和純度
基本方案 用近紫外光譜法分析蛋白質
7.3單元 測定重組蛋白的一致性和結構
基本方案 測定重組蛋白的二硫鍵模式
7.4單元 橫向尿素梯度電泳
基本方案
7.5單元 分析型超速離心
7.6單元 測定蛋白質的圓二色譜
基本方案 記錄CD譜
輔助方案 遠紫外CD譜的解釋
7.7單元 測定蛋白質的螢光光譜法
基本方案 記錄螢光發射光譜
7.8單元 用差示掃描量熱法測量蛋白質的熱穩定性
基本方案 差示掃描量熱法
輔助方案1 電校準
輔助方案2 用碳氫化合物膠囊進行溫度校準
輔助方案3 用脂懸液進行溫度校準
輔助方案4 DSC比色杯的維護和清潔
7.9單元 用HPLC凝膠過濾和質譜法對蛋白質進行定性
策略設計
基本方案 重組蛋白的HPLC分析
輔助方案 重組蛋白的MALDIMS分析
第8章 常規層析分離
8.1單元 常規層析概述
目的蛋白的收率和純度
純化策略的步驟
影響層析解析度的參數
8.2單元 離子交換層析
策略設計
基本方案1 批量吸附和逐步提高鹽濃度的梯度洗脫
備擇方案 基於pH的分步梯度洗脫
基本方案2 線性梯度洗脫的柱層析
輔助方案1 用試管預試驗確定離子交換層析的起始條件
輔助方案2 離子交換柱動態 (柱)容量和處理容量的測量
輔助方案3 梯度形成技術
輔助方案4 離子交換介質的清洗和再生
輔助方案5 離子交換介質的保存
8.3單元 凝膠過濾層析
策略設計
基本方案1 脫鹽(分組分離)
基本方案2 蛋白質分級分離
基本方案3 測定分子大小
備擇方案 柱校準
8.4單元 疏水相互作用層析
策略設計
基本方案1 用膠珠≥90μm的HIC介質裝柱
備擇方案 用膠珠≤34μm的HIC介質裝柱
基本方案2 測試裝填的柱床
基本方案3 從HIC柱上洗脫蛋白質
輔助方案 HIC柱的再生、清潔和貯存
8.5單元 肽和蛋白質的HPLC
啟動程式
HP-SEC的標準操作條件
HP-NPC的標準操作條件
HP-HIC的標準操作條件
HP-IEX的標準操作條件
HP-HILIC的標準操作條件
HP-IMAC的標準操作條件
HP-BAC的標準操作條件
RP-HPLC的標準操作條件
用RP-HPLC技術對肽和蛋白質混合物進行脫鹽處理
RP-HPLC方法的建立
第9章 親和層析
9.1單元 凝集素親和層析
基本方案 Con A Sepharose親和層析
輔助方案 確定凝集素結合和洗脫條件的預實驗
備擇方案 麥胚凝集素(WGA) Agarose親和層析
9.2單元 染料親和層析
基本方案1 用層析法選擇各成分
基本方案2 陰性層析
基本方案3 使用分步洗脫的陽性層析
輔助方案 活性染料的固定化
9.3單元 天然配體的親和純化
基本方案CNBr活化
備擇方案1 用對硝基苯基氯甲酸酯活化
備擇方案2 用2,2,2三氟乙烷基磺醯氯活化
9.4單元 金屬螯合親和層析(MCAC)
策略設計
基本方案 用於純化可溶性帶組氨酸尾融合蛋白的非變性MCAC
備擇方案1 用於純化不溶性帶組氨酸尾的融合蛋白的變性MCAC
備擇方案2 MCAC純化後蛋白質的固相復性
輔助方案1 純化後蛋白質的分析和處理
輔助方案2 NTA樹脂的再生
9.5單元 免疫親和層析
基本方案 可溶性或膜結合抗原的分離
備擇方案1 抗原的低pH洗脫
備擇方案2 抗原的批量純化
備擇方案3 辛基βD葡萄糖苷的洗脫
輔助方案 抗體Sepharose的製備
9.6單元 免疫沉澱
基本方案1 用非變性去污劑溶液裂解的細胞懸液進行免疫沉澱
基本方案2 免疫沉澱再捕獲
第10章 電泳
10.1單元 蛋白質的單向SDS凝膠電泳
電流和電泳
基本方案 變性(SDS)不連續聚丙烯醯胺凝膠電泳：Laemmli法
備擇方案1 在Tris Tricine緩衝液系統中電泳
備擇方案2 在梯度凝膠中分離蛋白質
輔助方案 灌制多塊梯度膠
10.2單元 非變性條件的單向凝膠電泳
基本方案 非變性連續聚丙烯醯胺凝膠電泳
備擇方案 非變性不連續電泳和分子質量標準曲線(Ferguson曲線)的製作
10.3單元 雙向凝膠電泳
基本方案1 套用固相pH梯度凝膠條進行等電聚焦
基本方案2 IPG凝膠的第二向電泳
備擇方案 對角線凝膠電泳(非還原/還原凝膠)
10.4單元 利用固定法檢測凝膠中的蛋白質
基本方案1 考馬斯亮藍R250染色
備擇方案1 快速考馬斯亮藍G250染色
備擇方案2 酸性考馬斯亮藍G250染色
基本方案2 SYPRO Ruby染色
基本方案3 銀染
備擇方案3 非氨鹽銀染
備擇方案4 快速銀染
輔助方案 凝膠成像
10.5單元 聚丙烯醯胺凝膠電印跡
基本方案 電印跡到PVDF膜上
備擇方案1 用於序列分析的蛋白質電印跡
備擇方案2 電印跡至硝酸纖維素膜上
備擇方案3 在半干係統中的蛋白質電印跡
10.6單元 檢測印跡膜上的蛋白質
基本方案1 氨基黑染色
基本方案2 考馬斯亮藍R250染色
基本方案3 麗春紅S染色
基本方案4 膠體金染色
基本方案5 膠體銀染色
基本方案6 印度墨汁染色
基本方案7 螢光胺標記
10.7單元 免疫印跡檢測
基本方案 使用直接耦聯的第二抗體進行免疫探測
備擇方案 用耦聯到第二抗體上的抗生物素蛋白生物素進行免疫探測
輔助方案1 用發色底物顯跡
輔助方案2 用發光底物顯跡
第11章 化學分析
11.1單元 溶液中蛋白質的酶解
基本方案 非變性條件下的蛋白質消化
備擇方案1 尿素或鹽酸胍溶液中的蛋白質消化
備擇方案2 SDS溶液中的蛋白質消化
輔助方案1 酶貯液的製備和使用
輔助方案2 消化混合物中肽的還原和S烷基化
11.2單元 在PVDF膜上酶解蛋白質
基本方案 在氫化Triton X100緩衝液中消化結合在PVDF膜上的蛋白質
11.3單元 測序用蛋白質的膠中消化
基本方案 在含Tween 20的膠中消化蛋白質
備擇方案1 在含十二烷基磺酸鈉的凝膠中消化蛋白質
備擇方案2 在不含去污劑的凝膠中消化蛋白質
11.4單元 溶液中蛋白質的化學切割
基本方案1 用溴化氰從甲硫氨酸殘基的C端切割
基本方案2 用BNPS3甲基吲哚切割色氨酸殘基的C端
基本方案3 用甲酸切割天冬氨酸脯氨酸肽鍵
基本方案4 用羥胺切割天冬醯胺甘氨酸肽鍵
基本方案5 用NTCB切割半胱氨酸殘基的N端
11.5單元 膜上蛋白質的化學切割
基本方案1 用溴化氰切割甲硫氨酸殘基的C端
備擇方案 用溴化氰切割Edman降解法分析過的結合在PVDF膜上的蛋白質
基本方案2 BMPS3甲基吲哚法切割色氨酸殘基的C端
基本方案3 甲酸切割天冬氨酸脯氨酸肽鍵
基本方案4 用羥胺切割天冬醯胺甘氨酸肽鍵
基本方案5 用NTCB切割半胱氨酸的N端
11.6單元 反相HPLC分離肽
基本方案1 用反相HPLC分離5～500pmol的肽
基本方案2 用反相HPLC分離≤5pmol的肽
輔助方案 毛細管HPLC系統的組裝
11.7單元 N端序列分析
儀器使用
樣品製備
第12章 翻譯後修飾：糖基化
12.1單元 N糖基化的抑制
基本方案 N糖基化的抑制
輔助方案 丙酮沉澱
12.2單元 N連線寡糖的內切糖苷酶和糖胺酶的釋放
基本方案1 內切糖苷酶H消化
基本方案2 肽：N糖苷酶F消化
輔助方案 估測糖蛋白中N-連線寡糖鏈的數目
基本方案3 唾液酸酶(sialidase或neuraminidase)消化
12.3單元 蛋白質上糖磷脂錨的檢測
基本方案1 用Triton X114對細胞或膜總蛋白質進行提取和分級分離
備擇方案 用Triton X114對所獲蛋白質進行分級分離
基本方案2 通過完整細胞的PIPLC消化鑑定GPI錨定的蛋白質
第13章 翻譯後修飾：磷酸化和磷酸酶
13.1單元 用32Pi標記培養細胞及製備用於免疫沉澱的細胞裂解物
基本方案 用32Pi標記培養細胞及用溫和去污劑裂解
備擇方案 在SDS中煮沸裂解細胞
13.2單元 磷酸胺基酸的分析
基本方案 利用酸水解和雙向電泳法分析磷酸胺基酸
備擇方案 鹼處理以增強點在濾膜上的含磷酸化酪氨酸和磷酸化蘇氨酸的蛋白質的檢測
13.3單元 用免疫學技術檢測磷酸化
基本方案 用抗磷酸酪氨酸抗體進行免疫印跡及用[125I]蛋白A進行檢測
備擇方案 用增強化學發光(ECL)檢測結合的抗體
13.4單元 用酶學技術檢測磷酸化
基本方案1 用非特異性酸性磷酸酶消化磷蛋白
備擇方案1 用非特異性鹼性磷酸酶消化磷蛋白
基本方案2 用蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶消化磷蛋白
備擇方案2 用蛋白酪氨酸磷酸酶消化磷蛋白
13.5單元 用透化處理的策略研究蛋白質的磷酸化
基本方案 在透化處理的細胞中分析蛋白質的磷酸化
13.6單元 磷酸肽作圖及磷酸化位點的鑑定
基本方案 SDSPAGE分離的蛋白質經胰蛋白酶水解後進行磷酸肽作圖
備擇方案 固定化蛋白質的水解消化
輔助方案 用於微量序列測定或質譜分析的磷酸肽的製備
第14章 翻譯後修飾：特定的套用
14.1單元 二硫鍵形成的分析
基本方案 在完整單層細胞中分析二硫鍵的形成
備擇方案 在懸浮細胞中分析二硫鍵的形成
14.2單元 蛋白質醯化的分析
基本方案1 用脂肪酸進行生物合成標記
基本方案2 脂肪酸連線到蛋白質的分析
基本方案3 細胞提取物中總蛋白質結合的脂肪酸標記的分析
基本方案4 脂肪酸標記一致性的分析
14.3單元 蛋白質異戊烯化和羧甲基化的分析
基本方案1 培養細胞中蛋白質的異戊烯化
基本方案2 培養細胞中蛋白質的羧甲基化
14.4單元 蛋白質氧化修飾的分析
基本方案1 用2,4二硝基苯肼對蛋白質羰基進行分光光度定量
基本方案2 用氚標記的硼氫化鈉定量蛋白質羰基衍生物
基本方案3 凝膠電泳分析［14C］碘乙醯胺標記的蛋白質巰基
基本方案4 用質譜定量蛋白質的二酪氨酸殘基
輔助方案1 O,O′二酪氨酸標準品的製備
輔助方案2 用競爭性ELISA分析蛋白質結合的硝基酪氨酸
基本方案5 異天冬氨酸形成的酶學分析
14.5單元 蛋白質泛素化的分析
基本方案1 目的蛋白的免疫沉澱及隨後的抗Ub免疫印跡
基本方案2 從表達His6Ub的細胞中親和純化泛素化的蛋白質
第15章 蛋白質的化學修飾
15.1單元 半胱氨酸的修飾
策略設計
基本方案1 用醯鹵試劑(haloacyl reagent)或N乙基馬來醯亞胺對已知大小和組成的蛋白質進行烷基化
基本方案2 用N碘乙基三氟乙醯胺進行烷基化
基本方案3 用丙烯醯胺進行烷基化
基本方案4 二硫化物的空氣氧化
輔助方案1 比色法定量游離巰基
輔助方案2 半胱氨酸修飾後的樣品脫鹽
15.2單元 氨基的修飾
策略設計
基本方案1 用琥珀醯亞胺酯進行醯胺化
基本方案2 異硫氰酸螢光素的加入
基本方案3 琥珀醯化
基本方案4 還原性甲基化
第16章 質譜
16.1單元 肽和蛋白質質譜分析綜述
在蛋白質結構分析中，為什麼質譜是一種必需的工具？
什麼是MS？
什麼是串聯質譜？
MS數據能夠定量嗎？
樣品製備
質量測定準確性和質量解析度的基本原理
16.2單元 肽和蛋白質MALDI質量分析用樣品的製備
基本方案1 乾滴法
基本方案2 快速蒸發法
輔助方案 HCCA的純化/重結晶
16.3單元 用於MALD-MS指紋圖蛋白質的凝膠內消化
基本方案
16.4單元 在網上搜尋序列資料庫：用MS-Fit鑑定蛋白質
基本方案
16.5單元 在網上搜尋序列資料庫：用MS-Tag鑑定蛋白質
基本方案
16.6單元 使用納升噴霧連線裝置將樣品直接導入電噴霧離子化質譜儀中
16.7單元 使用微型毛細管液相色譜將樣品直接導入電噴霧離子化質譜儀中
基本方案1 製作集成式LC柱ES針頭
基本方案2 裝配ES針頭
基本方案3 微量ES LC/MS連線總成的安裝和使用
16.8單元 用四極桿離子阱質譜和SEQUEST資料庫匹配鑑定蛋白質
基本方案
16.9單元 通過手工解釋MS/MS譜進行從頭肽測序
基本方案 MS/MS譜的手工解釋
輔助方案1 通過甲基酯化證實新測定的序列
輔助方案2 通過乙醯化證實新測定的序列
第17章 肽的製備和處理
17.1單元 在塑膠針上合成多種肽
基本方案 肽的多合成針合成
輔助方案1 製備活化的Fmoc保護的胺基酸溶液
輔助方案2 肽的N端乙醯化
輔助方案3 肽的N端生物素化
17.2單元 用於生產識別完整蛋白質的抗體的合成肽
基本方案1 計算機輔助選擇適當的抗原肽序列
備擇方案1 手工檢查以選擇合適的肽序列
基本方案2 設計用於耦聯到載體蛋白質上的合成肽
備擇方案2 設計一種合成的多抗原肽
基本方案3 使用異型雙功能交聯劑將合成肽耦聯到載體蛋白質上
輔助方案1 用Ellman試劑分析游離的巰基
輔助方案2 還原肽中的半胱氨酸基團
備擇方案3 使用同型雙功能試劑將合成的肽耦聯到載體蛋白質上
備擇方案4 使用碳二亞胺將合成肽耦聯到載體蛋白質上
輔助方案3 肽與載體蛋白質摩爾比率的計算
17.3單元 作為蛋白質模擬物的肽樹枝狀高分子的合成和套用
基本方案1 MAP系統的直接Bos合成
備擇方案 直接Fmoc固相合成MAP系統
輔助方案1 茚三酮試驗
輔助方案2 用透析法純化MAP系統
輔助方案3 使用高效凝膠過濾層析純化MAP
基本方案2 末端加到側鏈上的cMAP的直接合成
17.4單元 肽二硫鍵的形成
基本方案1 用空氣氧化促進二硫鍵的形成
備擇方案1 通過在樹脂上空氣氧化促進二硫鍵的形成
備擇方案2 活性炭/空氣介導的分子內二硫化物的形成
基本方案2 通過鐵氰化鉀氧化形成分子內二硫化物
備擇方案3 通過鐵氰化鉀氧化形成分子間或分子內二硫化物
備擇方案4 通過鐵氰化鉀氧化在樹脂上形成二硫化物
基本方案3 在弱酸性pH條件下用DMSO氧化
備擇方案5 在弱鹼性pH條件下用DMSO氧化
基本方案4 用氧化還原緩衝液氧化
基本方案5 由固相Ellman試劑介導的氧化
基本方案6 用碘同時去保護/氧化
備擇方案6 用碘在樹脂上同時進行S-ACM去保護/氧化
基本方案7 用Tl(III)同時進行S-ACM去保護/氧化
備擇方案7 用Tl(III)在樹脂上同時進行S-ACM去保護/氧化
基本方案 8烷基三氯矽烷亞碸氧化
第18章 蛋白質互相作用的鑑定
18.1單元 蛋白質蛋白質相互作用的分析
基本概念
平衡參數
動力學參數
18.2單元 用相互作用阱/雙雜交系統鑑定相互作用的蛋白質
18.3單元 用基於噬菌體的表達克隆鑑定相互作用的蛋白質
策略設計
18.4單元 用共沉澱法檢測蛋白質蛋白質相互作用
基本方案 與蛋白ASepharose或蛋白GSepharose共沉澱的蛋白質
備擇方案 GST融合蛋白的共沉澱
18.5單元 用酵母雙雜交晶片高通量篩選蛋白質蛋白質相互作用
基本方案1 蛋白質組規模的酵母蛋白質晶片的製備
基本方案2 用酵母蛋白質晶片對蛋白質相互作用進行手工篩選
18.6單元 用far Western分析鑑定蛋白質的相互作用
基本方案蛋白質混合物的far Western分析
備擇方案1 用免疫印跡檢測相互作用的蛋白質
備擇方案2 在far Western印跡中用肽鑑定特異性的相互作用序列
18.7單元 用於研究生物分子相互作用的閃爍鄰近分析法(SPA)
第19章 蛋白質相互作用的定量
19.1單元 蛋白質相互作用定量的概述
表面等離子共振
分析型超速離心(沉降平衡和沉降速度)
19.2單元 滴定量熱法(titration calorimetry)
基本方案1 用恆溫滴定微量量熱法確定摩爾比率、觀察的親和力(Kobsd)和觀察的結合焓的變化(ΔHobs)
基本方案2 用ITC確定生物化學結合熱力學：ΔGo′、ΔHo′和ΔCo′p
19.3單元 用於測量蛋白質締合平衡的縮比大區帶分析型凝膠過濾層析
基本方案 縮比大區帶分析型凝膠過濾層析
輔助方案1 數據分析
輔助方案2 蛋白質裝配過程的動量學和化學計量的確定
單體二聚體平衡締合測量數據的調整
19.4單元 帶線上式光散射的分子排阻層析
基本方案1 使用折射率和光散射計算不含碳水化合物蛋白質的分子質量和自締合程度(雙檢測器法)
備擇方案1 合用光散射檢測器和紫外檢測器來計算非糖基化蛋白質的分子質量(雙檢測器法)
備擇方案2 用於大蛋白質的分子排阻層析和光散射：DEBYE分析
備擇方案3 絕對分子質量校準法
基本方案2 使用光散射和反射率計算不含碳水化合物的蛋白質蛋白質複合物的化學計量
備擇方案4 使用光散射和紫外計算糖蛋白的蛋白質蛋白質相互作用的化學計量
第20章 肽酶
20.1單元 蛋白酶
蛋白酶的生物學重要性
蛋白酶的命名法
可有效地細分許多蛋白酶的3種方式
20.2單元 釀酒酵母蛋白酶體的純化和定性
基本方案1 用陰離子交換層析和凝膠過濾純化酵母26S蛋白酶體
備擇方案 用親和層析純化酵母26S蛋白酶體
基本方案2 用常規層析純化酵母20S蛋白酶體
輔助方案1 26S和20S蛋白酶體肽酶活性的分析
輔助方案2 多聚泛素化溶菌酶的製備
輔助方案3 放射性標記酪蛋白的製備
輔助方案4 用26S蛋白酶體降解蛋白質底物
輔助方案5 蛋白酶體的非變性凝膠電泳/膠內肽酶分析
20.3單元 真核生物20S蛋白酶體的純化
基本方案 從牛腦垂體純化20S蛋白酶體
輔助方案 分析蛋白酶體催化的切割的酶分析法
20.4單元 絲氨酸蛋白酶抑制劑
基本方案1 用柱層析純化人抗凝血酶
輔助方案 洗脫組分中抗凝血酶的分析
基本方案2 在無糖胺聚糖存在的情況下分析抗凝血酶抑制——"遞增的抗凝血酶活性"
基本方案3 在糖胺聚糖存在的情況下分析抗凝血酶抑制——"肝素輔因子活性"
20.5單元 用GFP作為報導蛋白分析序列特異性蛋白酶
基本方案 位點特異性蛋白酶的螢光分析
輔助方案 用金屬螯合層析純化底物-GFP融合蛋白
備擇方案 位點特異性蛋白酶的螢光共振能量轉移分析
20.6單元 活性絲氨酸蛋白酶及其變異體的過表達和從大腸桿菌包含體中的純化
基本方案1 微小纖溶酶原及其變異體的過表達和從大腸桿菌包含體中的純化
基本方案2 微小纖溶酶原的激活及具有催化活性微小纖溶酶的純化
輔助方案1 確定重組微小纖溶酶活性的分析方法
輔助方案2 確定活性位點濃度的分析方法
20.7單元 在細胞環境中分析蛋白酶
基本方案1 用細胞滲透性肽底物原位監測細胞內蛋白酶的活性
基本方案2 通過自溶激活和內源底物蛋白質降解原位監測細胞內蛋白酶活性
基本方案3 監測細胞裂解物反映出的蛋白酶活性水平
基本方案4 原位監測分泌的蛋白酶活性
基本方案5 用酶譜法測量細胞分泌的MMP活性
20.8單元 caspase的表達、純化和定性
基本方案1 caspase在大腸桿菌中的表達
基本方案2 caspase酶分析
輔助方案1 重組caspase的滴定
輔助方案2 caspase底物的製備
第21章 基於凝膠的蛋白質組分析
21.1單元 使用雙向差異凝膠電泳(2DDIGE)確定蛋白質譜
基本方案用花青染料(CyDye DIGE螢光素)標記蛋白質用於雙向電泳
輔助方案 用於Cy標記反應的蛋白質的製備
備擇方案 用質譜技術鑑定DIGE膠中的蛋白質
21.2單元 用於蛋白質組分析的雷射捕獲顯微分離技術
基本方案1 雷射捕獲顯微分離技術(LCM)
備擇方案 LCM組織切片的免疫標記
輔助方案1 LCM分析用組織的收集和保存
輔助方案2 使用SYPRO RUBY染料對LCM捕獲材料中的蛋白質進行定量
基本方案2 使用免疫印跡分析LCM捕獲的材料
基本方案3 SELDI質譜
附錄1 試劑和溶液
附錄2 常用的度量制和數據
附錄3 常用技術
附錄3A 蛋白質摺疊劑的使用
附錄3B 透析
附錄3C 玻璃器具矽烷化
附錄3D 使用硫酸銨的蛋白質沉澱
附錄3E 瓊脂糖凝膠電泳
附錄3F 用吸收光譜法進行核酸定量
附錄4 試劑和設備供貨商
參考文獻
索引
