《粘細菌自有質粒pMF1複製和分配的遺傳機制》是依託山東大學，由李越中擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：粘細菌自有質粒pMF1複製和分配的遺傳機制
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：李越中
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
粘細菌是研究原核生物細胞間信號調控和進化的重要模式生物，同時也是尚待開發的重要藥源微生物類群。半個多世紀的粘細菌研究一直未能分離得到內源性質粒，而其他廣宿主質粒均不能在粘細菌細胞中自主複製。有限的遺傳操作技術極大地限制了粘細菌遺傳學研究的開展。.2006年我們在國際上首次發現粘細菌的自有質粒pMF1。這是目前唯一在粘細菌中發現的自主複製質粒。本申請將在前期工作基礎上研究pMF1質粒的複製和分配機制，內容包括複製蛋白和與複製蛋白相互作用的質粒序列確定，以及作用方式；影響pMF1質粒在子細胞中遺傳分配的par基因系統和控制方式；構建基於遺傳分配穩定的粘細菌高效遺傳作業系統。
結題摘要
粘細菌具有複雜的社會學行為，並能產生豐富的次級代謝產物。pMF1 是目前發現的唯一的粘球菌內源質粒，構建遺傳穩定的穿梭載體對於粘細菌研究具有重要的意義。通過逐段篩選，我們找到了能顯著提高穿梭載體遺傳穩定性的區域，位於nt 17242-50，並成功構建了穩定的穿梭質粒pZJY4111。該區域包含三個完整的orf及其位於上下游的兩個iterons。通過生物信心學比對發現，pMF1.22與Sphingobium japonicum ParA-like 蛋白在胺基酸序列上有56%的相似度， 包含walk-type ATPase的四個保守模組，因此將pMF1.22命名為ParA。pMF1.21和pMF1.23沒有比對到同源蛋白。DNase I footprinting和EMSA實驗證實pMF1.23與上下游的兩個iterons具有結合活性，對整個操縱子的轉錄有負調控作用，命名為ParB。pMF1.21沒有DNA結合活性，但是能增強ParB的DNA結合活性和轉錄負調控作用，命名為ParC。螢光融合實驗表明ParC在粘球菌DZ1中能自然表達，並且對宿主的生長速率和代時有一定的影響，具體機制仍不清楚。在pMF1上分散存在6個類iterons，雖然EMSA實驗表明這6個類iterons與ParB均具有結合活性，但質粒穩定性實驗表明只有位於啟動子區內的ItA是必需的。綜上結果表明pMF1的自主分配區域具有新穎性，不同於傳統低拷貝質粒自主分配區域的基因模組組成和功能行使模式。Southern blot實驗證明pMF1的複製方式為滾換複製，自主複製區是一個包含4個orf（pMF1.13-pMF1.16）的操縱子。pMF1.14是複製起始蛋白，沒有典型的DNA結合結構域，但是含有豐富的重複序列。最小複製區約為370bp，位於pMF1.14內部，富含正向或反向重複序列。體內和體外實驗均證實了pMF1.14與最小複製區的結合活性。自主複製區的特點可能是pMF1為嚴謹型的原因。
