維生素B1結構中噻唑環在鹼性介質中可被高鐵氰化鉀等氧化劑氧化，然後與嘧啶環上的氨基（-NH2）縮合生成具有螢光的硫色素，後者易溶於異丁醇中顯強烈的藍色螢光，該反應又稱為硫色素螢光反應。
基本介紹
- 中文名：硫色素螢光反應
- 原理：與對照品比較螢光強度
- 方法：氧化試劑的製備
- 概述：可被高鐵氰化鉀等氧化劑氧化
概述,原理,方法,氧化試劑的製備,對照品溶液的製備,供試品溶液的製備,測定方法,計算,討論,
概述
維生素B1結構中噻唑環在鹼性介質中可被高鐵氰化鉀等氧化劑氧化，然後與嘧啶環上的氨基（-NH2）縮合生成具有螢光的硫色素，後者易溶於異丁醇中顯強烈的藍色螢光，該反應又稱為硫色素螢光反應。此反應為維生素B1所特有，也是其專屬檢測分析反應。
原理
維生素B1在鹼性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，用異丁醇提取後，在紫外光(λex365m)照射下呈現藍色螢光(λem435m)。通過與對照品比較螢光強度，即可求得供試品含量。
方法
氧化試劑的製備
取當天配製的1.0%鐵氰化鉀溶液4.0ml，加3.5mol/L的氫氧化鈉溶液製成100ml，於4h內使用。
對照品溶液的製備
精密稱取維生素Bl對照品約25mg，溶於300ml的稀醇溶液(1→5)，用3mol/L鹽酸溶液調節至pH4.0，加稀醇稀釋成1000ml，作為貯備液。避光冷藏，每月配製一次。取貯備液適量，用0.2mol/L鹽酸溶液逐步定量稀釋至0.2µg/ml的溶液。
供試品溶液的製備
取供試品適量，用0.2mol/L鹽酸溶液溶解製成100µg/ml的溶液(若供試品難溶，可在水浴上加熱使溶解)，精密量取5ml，逐步定量稀釋至0.2µg/ml的溶液。
測定方法
取40ml具塞試管(或其他合適容器)3支或3支以上，各精密加入對照品溶液5ml，於其中2支(或2支以上)試管中迅速(1~2s內)加入氧化劑各3.0ml，在30s內再加入異丁醇20.0ml，密塞，劇烈振搖90s。於另一文試管中加3.5mol/L 氫氧化鈉溶液3.0ml以代替氧化試劑，並照上述方法操作，作為空白。
另取3支或3支以上的相同試管，各精密加入供試品溶液5ml，照上述對照品溶液管的方法，同法處理。
於上述6支或6支以上試管中，各加入無水乙醇2ml，旋搖數秒鐘，待分層後，取上層澄清的異丁醇液約10ml，置螢光計測定池內，測定其螢光強度(螢光計的輸入和輸出的最大波長分別為365nm和435nm)。
計算
5ml供試品溶液中維生素B1的µg數=（A﹣b）/（S﹣d）×0.2×5
式中，A和S分別為供試品溶液和對照品溶液側得的平均螢光讀數；b和d分別為其相應的空白讀數；0.2為對照品溶液的濃度(µg/ml)；5為測定時對照品溶液的取樣體積(ml)。
討論
(1)硫色素反應為維生素Bl的專屬反應，雖非定量完成，促在一定條件下形成的硫色素與維生素Bl濃度成正比，且回收恆定。故可用於維生素Bl及其製劑的含量測定。
(2)本法為維生素B1所特有，故不受氧化破壞產物的干擾，測定結果較為準確。但操作繁瑣，且螢光測定受多種因素干擾；
(3)本法中使用的氧化劑，除鐵氰化鉀外、尚可用氯化汞或溴化氰。其中，溴化氰能將維生素Bl完全定量地氧化為硫色素，在較寬的濃度範圍內與螢光強度成正比，且尿液中某些代謝產物不干擾測定。故亦適用於臨床體液分析。
