眾所周知，微量元素硒在體內主要是利用UGA密碼子以硒代半胱氨酸的形式，插入各種硒蛋白或硒酶以發揮其生物功能的。在硒代半胱氨酸的合成中硒磷酸合成酶催化合成硒磷酸(H3PO3Se，SeP)，硒代磷酸作為供硒體在硒代半胱氨酸的合成中發揮重要作用。
基本介紹
- 中文名：硒磷酸合成酶
- 外文名：selenophosphate synthetase
- 本質：蛋白質
- 分子量：37kDa
- 組成：7個半胱氨酸殘基
- 活性殘基：第17號半胱氨酸殘基
簡介,硒磷酸合成酶的理化特徵,硒磷酸合成酶的酶促反應動力學,硒磷酸合成酶的基因突變研究,兩種硒磷酸合成酶及其分布,SPS1,SPS2,
簡介
硒磷酸合成酶的理化特徵
從大腸桿菌分離純化的硒磷酸合成酶是由347個胺基酸組成的分子量為37 kDa的疏水性單體蛋白質。高度純化的硒磷酸合成酶至少可在-80℃保存1年而活性不下降。該酶對熱較穩定，如由10 mg酶蛋白/mL、100 mmol/L Tricine-KOH、2 mmol/L DTT、0.1 mmol/L EDTA組成的體系(pH-7.2)，在50℃或60℃加熱5 min，酶活性不損失，但在70℃加熱則酶完全失活。pH在7.2～8.0之間變化對硒磷酸合成酶催化的反應速度無明顯影響。
早先為了保護硒磷酸合成酶免遭氧化失活而在所有緩衝液中加入DTT和EDTA，但是現已證實它在無DTT時暴露在氧氣中也不失活。不過，H2O2對硒磷酸合成酶有抑制作用。在pH-7.2時，若無DTT和EDTA存在，則隨著H2O2濃度增加，催化活性逐漸下降，H2O2濃度為3 mmol/L時，酶活性喪失50%，H2O2為20 mmol/L時，酶活性完全喪失。目前認為H2O2抑制硒磷酸合成酶活性的一個可能原因是H2O2與催化反應所必需的半胱氨酸反應生成RSOH。
硒磷酸合成酶的酶促反應動力學
ATP是硒磷酸合成酶的特異性底物，CTP、GTP、UTP、焦磷酸、多聚磷酸或ATP的γ-硫類似物ATPγS都不能代替ATP。硒磷酸中的磷酸來自ATP的γ-磷酸基團。反應體系中必須有Se2-共存時，反應方能順利進行。除硒之外，迄今未發現硒磷酸合成酶能催化其他元素的磷酸化。
Veres等曾極為小心地確保反應體系嚴格無氧和硒全部處於還原態，測得硒磷酸合成酶對ATP(NaSeH達飽和，改變ATP的濃度)和硒化合物(ATP達飽和，改變NaSeH的濃度)的Km值分別為0.9 mmol/L和7.3 μmol/L。考慮到培養細菌和多種真核細胞的培養基最適硒濃度僅在0.1～1 μmol/L範圍內，所以讓人產生Se2-是否是硒磷酸合成酶的天然底物的疑問。
核苷酸類似物8一疊氮一ATP對硒磷酸合成酶催化反應具有競爭性抑制，其Ki值為0.95 mmol/L。硒磷酸合成酶反應的最終產物中明顯抑制催化活性的僅是AMP。AMP對ATP具有競爭性抑制，Ki值為170 μmol/L。硒磷酸合成酶受抑制將造成細胞內SeP、Sec-tRNA水平下降，最終導致具有各種重要生理功能的硒蛋白和硒酶水平下降。硒磷酸合成酶反應的其他終產物對其催化活性的抑制較弱，SeP濃度提高到1.5 mmol/L和2.5 mmol/L時，才對硒磷酸合成酶分別抑制12%和26%；SeP為0.5 mmol/L時無抑制。由SeP的硫代類似物硫代磷酸得到相同程度的抑制需高得多的濃度(10～20 mmol/L)。高度純化的硒磷酸合成酶既不生成也不能利用ADP，ADP對反應速度也沒有影響。基於以上結果，說明總反應分多步進行。另外，由於在無硒化合物存在時，硒磷酸合成酶可催化ATP完全轉化為AMP和正磷酸，所以可假設該反應釋放AMP時先形成不穩定的酶一焦磷酸中間體。不過該中間體尚未得到任何實驗證實。
某些金屬離子對硒磷酸合成酶的催化作用有重要影響。鎂離子是硒磷酸合成酶活性所必需的，最適範圍是Mg2+與ATP濃度比為1：1～2：l。其他二價陽離子如錳和鈷均不能明顯激活硒代磷酸合成酶。低濃度鋅(μmol/L範圍)既抑制硒磷酸合成酶與ATP的結合，也抑制其催化活性。硒磷酸合成酶的催化活性除需二價陽離子外，還需一價陽離子K+，NH+或Rb+可部分替代K+，但反應速度略有不同，相對於K+(速度定為1)，NH4+和Rb+的反應速度分別為0.78和0.75。Li+和Na+不僅不激活酶，而且在有K+存在時抑制酶活性。
硒磷酸合成酶的基因突變研究
關於E.coli硒磷酸合成酶的活性中心及其與ATP的結合特性還通過基因突變實驗進行了研究。硒磷酸合成酶的近氨基端有一個富含甘氨酸區，該區內Cys一17和Lys一20對酶催化活性是必需的，用絲氨酸取代Cys—19不影響酶活性。在研究ATP與硒磷酸合成酶結合位點時以Mn—ATP替代催化活性所必需的Mg-ATP，用絲氨酸取代Cys一17或Cys一19，對ATP的結合影響很小。但是Cys—17、Cys一19均發生突變或Lys一20發生突變時，硒磷酸合成酶與ATP結合的親和力則顯著下降。採用γ-32P 8-疊氮一ATP、32P—ATP和14C—ATP的研究結果進一步支持了這兩個半胱氨酸殘基對ATP與硒磷酸合成酶的結合的重要性。
兩種硒磷酸合成酶及其分布
近年來陸續發現哺乳動物、細菌和古細菌中廣泛存在硒磷酸合成酶的證據，而且最近還發現了一種與大腸桿菌硒磷酸合成酶不同的硒磷酸合成酶，其酶蛋白中含有一個可能影響催化活性的硒代半胱氨酸。為了區別，現將含硒半胱氨酸的硒磷酸合成酶稱為SPS2，不含硒代半胱氨酸者稱為SPS1。
SPS1
除大腸桿菌外，還在人、牛、小鼠、大鼠和一種典型的古細菌甲烷球菌屬的M.Vannielii檢測到SPS1的存在。Stadtman實驗室發現大鼠腦、腎、肝、肺、睪丸、子宮、脾和心臟等8種組織中都存在SPS1，儘管後4種組織中SPS1含量較低。Berry實驗室克隆了小鼠和人的SPS1基因，它們與大腸桿菌硒磷酸合成酶基因有相似區段。其中有2個區段值得注意。其一是靠近羧基端的不變區B(GXGXXG)，它被稱為假設的ATP結合區，類似的胺基酸順序存在於許多結合ATP/GTP的蛋白質或蛋白激酶中。突變實驗結果提示，人SPS1該區段中所有胺基酸對正常的催化活性和與ATP的結合是重要的，但是直接證據的獲得還有待來自對人純化酶的詳細研究。其二是已知對大腸桿菌硒磷酸合成酶催化活性很重要的不變區A，該片段在大腸桿菌硒代磷酸合成酶位於N-端第13～20位胺基酸，在人位於M端第25～32位胺基酸。如前所述，Cys一17和Lys一20是大腸桿菌硒磷酸合成酶活性所必需的，該Cys一17在人SPS1中換成蘇氨酸是否會對其催化活性產生影響目前尚不清楚。
SPS2
最近從小鼠和人的某些細胞分離到一種含框內TGA碼(在mRNA是UGA)的硒代磷酸合成酶基因，其在哺乳動物COS一7細胞的表達產物在對應於TGA處含有硒代半胱氨酸，該酶被稱為SPS2。採用DNA·RNA雜交技術證明，SPS2優先在合成硒蛋白的組織(肝、腎和精巢)中表達。與哺乳動物其他硒蛋白的表達一樣，其mRNA的3'-非翻譯區是極為重要的。
Kim等將人和小鼠的SPS2的Cys突變基因(TGA換成Cys的密碼子)，以桿狀病毒為載體在昆蟲細胞中表達，得到的相應Cys一突變酶也具有硒磷酸合成酶活性。和大腸桿菌硒磷酸合成酶一樣，該酶只以ATP為專一性底物，其他三磷酸核苷無效。其催化活性也必需Mg2+，但Mg2+與ATP的物質的量比以2：1～4：1合適，而且高濃度Na+(5～20 mmol/L)對其活性幾乎無影響(有K+或無K+)，因此它的催化特性與大腸桿菌硒磷酸合成酶不盡相同。
