《產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用》是吉林農業大學於2015年5月18日申請的專利，該專利的公布號為CN104928210A，授權公布日為2015年9月23日，發明人是竇森、關松、王程玉、崔俊濤、胡永哲、王鐵媛、李立波。
《產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用》該產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌命名為堀越氏芽孢桿菌H-6，該分離方法是在無菌條件下，將油水淹地污染土壤樣品加入到含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基中，搖床培養，得到富集培養液；然後將得到的富集培養液依次加入到含油濃度分別為0.3％、0.5％、1％和2％的無機鹽液體培養基中，搖床培養，得到富集培養液；再將上述得到的富集培養液用無菌水稀釋後進行分離純化，待生長出單一菌落為止，對單一菌落進行篩選，得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌。該分離方法簡單，得到的菌株首次套用於降解石油烴類有機污染物，具有良好的降解效果。
2019年10月，《產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用》獲得第三屆吉林省專利獎優秀獎。
（概述圖為《產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用
- 申請人：吉林農業大學
- 申請號：2015102509237
- 申請日：2015年5月18日
- 公布號：CN104928210A
- 公布日：2015年9月23日
- 發明人：竇森、關松、王程玉、崔俊濤、胡永哲、王鐵媛、李立波
- 地址：吉林省長春市新城大街2888號
- Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I、C12N1/02(2006.01)I、B09C1/10(2006.01)I、C12R1/07(2006.01)N
- 代理機構：長春菁華專利商標代理事務所
- 代理人：李外
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
石油是一種天然的油狀粘稠物質，原油主要由95％～99.5％的烴類（正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環烴）及少量其它有機物（硫化物、氮化物、環烷酸類等）組成，有些石油樣品可含200～300種烴類，分子量從16（甲烷）至1000左右，其物理狀態包括氣體、揮發性液體、高沸點液體以及固體。
石油污染泛指原油和石油初加工產品（汽油、煤油、柴油、重油、潤滑油、瀝青等）及各類油的分解產物所引起的污染。近年來，隨著石油工業的迅猛發展，在石油的生產、貯運、煉製加工及使用的過程中，由於各種原因的泄漏造成石油烴類的溢出和排放，形成落地石油污染，這是土壤石油污染的主要途徑之一。全世界大規模開採石油是從20世紀初開始的，1900年全世界消費量約2000萬噸，100年來，這一數量已增長百餘倍，現在每年世界石油的總產量30多億噸，在國民經濟中占有十分重要的地位，有現代工業血液之稱。
中國自1978年石油產量突破1億t而成為世界十大產油國之一以來，2015年前已開發勘探的油氣田和油氣藏有400多個。1998年各石油、煉化企業工業固體廢棄物產生量為428.98萬t，利用率不到50％，工業固體廢棄物排放量為15.61萬t；截止2003年底，工業固體廢棄物累計堆存量1884.5萬t，占地181.7萬平方米，年平均產生石油污染土壤近10萬t，累計堆放量近50萬t。以上污染物排放統計，只是局限於對國有石油企業的調查，若考慮到地方油田企業排污量以及突發事故造成的污染和泄露，污染情況將更加嚴重。有研究表明，位於中國內蒙古的阿爾善油田，每口油井年平均落地原油為0.16～2t，污染草原植被面積為100×150平方米；中國大慶、遼河油田的重污染區的表層土壤（0～20cm）的含油量高達30％～50％；中國吉林省境內的莫莫格自然保護區，受污染局部表層土壤中總石油烴含量已經達到50000毫克·千克以上。石油污染場地，大面積植被遭到破壞，甚至退化為沙地、裸地，嚴重破壞了當地的農業生態環境。2015年前，石油污染問題已成為世界各國普遍關注的問題。
表面活性劑是一種能夠顯著降低溶劑表面張力的物質，是一種化學合成的產物，它可以改變有機污染物的某些性質，增加污染物與微生物細胞的接觸幾率，從而顯著提高微生物的降解能力。生物表面活性劑是微生物代謝活動的產物，它除具有化學表面活性劑所具有的作用外，還具有無毒、無污染、良好的選擇性、專一性和生物相容性好等優點。在增強土壤有機污染修復效率方面，有重要意義。通常採用微生物發酵法生產生物表面活性劑。細菌是生物表面活性劑的主要生產者之一，2015年前已報導過的能利用烴類的細菌及相對應的生物表面活性劑如假單胞菌屬Pseudomonassp.產生的鼠李糖脂，紅球菌屬Rhodococcussp.和節桿菌屬Arthrobactersp.產生的海藻糖脂，芽胞桿菌屬Bacillussp.產生的脂肽，氣單胞菌屬Aeromonassp.產生的糖脂，以及黃質菌屬Flavobacteriumsp.，不動桿菌屬Acinetobactersp.，棒桿菌Corynebacteriumsp.和葡萄球菌屬Staphylococcussp.等。中國國內2015年前關於表面活性劑產生菌的研究主要以假單胞菌屬和鼠李糖脂的研究居多，此外還包括地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌產生的脂肽類，氣單胞菌產生的糖脂和根癌土壤桿菌產生的表面活性物質，研究內容與國外相似。在中國國內對於堀越氏芽孢桿菌的研究僅見於堀越氏芽孢桿菌S184產河豚毒素的發酵條件最佳化方面的研究。國外對於堀越氏芽孢桿菌的研究也僅見於堀越氏芽孢桿菌產細胞外鹼性蛋白酶條件最佳化方面的研究（Jooetal.，2002）。中國國內外對於芽孢桿菌屬中堀越氏芽孢桿菌（Bacillushorikoshii）在利用石油烴類產生生物表面活性劑方面的研究還未見報導。
發明內容
專利目的
《產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用》的目的是為了提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用，該堀越氏芽孢桿菌產生的表面活性劑能降解石油烴類有機污染物。
技術方案
《產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用》首先提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌，命名為堀越氏芽孢桿菌（Bacillushorikoshii）H-6，菌種已於2015年1月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，（地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101）登記入冊編號為CGMCCNO.10372。
該發明還提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的分離方法，該方法包括：
步驟一：在無菌條件下，將油水淹地污染土壤樣品加入到含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基中，搖床培養，得到富集培養液；
步驟二：將步驟一得到的富集培養液依次加入到含油濃度分別為0.3％、0.5％、1％和2％的無機鹽液體培養基中，搖床培養，得到富集培養液；
步驟三：將步驟二得到的富集培養液用無菌水稀釋後進行分離純化，待生長出單一菌落為止，然後對單一菌落進行篩選，得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌。
優選的是，所述的油水淹地污染土壤樣品為在油水淹地污場地採集後於4℃下冷藏的新鮮土壤。
優選的是，所述的步驟一和步驟二的培養溫度為28～35℃，培養時間為7天。
優選的是，所述的步驟一和步驟二的無機培養基組成為：K2HPO46克、KH2PO46克、（NH4）2SO46克、MgSO4·7H202.6克、NaCl12克、CaCl2·H2O0.16克、蒸餾水1升、pH7.5±0.2。
該發明還提供上述產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌在降解石油烴類有機污染物上的套用。
優選的是，所述的產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌用於降解石油烴類有機污染物，具體步驟為：
將產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌單菌株從平板挑取單菌落一環接種到牛肉膏蛋白腖培養基中，在160轉·分鐘，28～35℃震盪培養18h，得到種子培養液，以石油為唯一碳源，按體積百分比為1％接種量將種子培養液接種至含油濃度為2％的無機鹽液體培養基中，在160轉·分鐘，28～35℃震盪培養7天，測定石油的殘餘濃度。
優選的是，所述的牛肉膏蛋白腖培養基組成為：牛肉膏3克、蛋白腖10克、NaCl25克、瓊脂15～20克、水1升，pH7.2±0.2。
有益效果
《產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用》從油水淹地污染土壤中分離出產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌，分離效果好，分離方法簡單，得到的菌株首次套用於降解石油烴類有機污染物，具有良好的降解效果，具有無毒、無二次污染、環境友好的特點。
附圖說明
圖1為不加菌劑和該發明產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的石油降解率對比結果圖。
附圖說明
權利要求
1.一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌，其特徵在於，命名為堀越氏芽孢桿菌（Bacillushorikoshii）H-6，菌種已於2015年1月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCNO.10372。
2.根據權利要求1所述的一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的分離方法，其特徵在於，該方法包括：
步驟一：在無菌條件下，將油水淹地污染土壤樣品加入到含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基中，搖床培養，得到富集培養液；
步驟二：將步驟一得到的富集培養液依次加入到含油濃度分別為0.3％、0.5％、1％和2％的無機鹽液體培養基中，搖床培養，得到富集培養液；
步驟三：將步驟二得到的富集培養液用無菌水稀釋後進行分離純化，待生長出單一菌落為止，然後對單一菌落進行篩選，得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌。
3.根據權利要求1所述的一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的分離方法，其特徵在於，所述的油水淹地污染土壤樣品為在油水淹地污場地採集後於4℃下冷藏的新鮮土壤。
4.根據權利要求1所述的一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的分離方法，其特徵在於，所述的步驟一和步驟二的培養溫度為28～35℃，培養時間為7天。
5.根據權利要求1所述的一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的分離方法，其特徵在於，所述的步驟一和步驟二的無機培養基組成為：K2HPO46克、KH2PO46克、（NH4）2SO46克、MgSO4·7H202.6克、NaCl12克、CaCl2·H2O0.16克、蒸餾水1升、pH7.5±0.2。
6.權利要求1所述的產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌在降解石油烴類有機污染物上的套用。
7.根據權利要求6所述的產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌在降解石油烴類有機污染物上的套用，其特徵在於，具體步驟為：
將產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌單菌株從平板挑取單菌落一環接種到牛肉膏蛋白腖培養基中，在160轉·分鐘，28～35℃震盪培養18h，得到種子培養液， 以石油為唯一碳源，按體積百分比為1％接種量將種子培養液接種至含油濃度為2％的無機鹽液體培養基中，在160轉·分鐘，28～35℃震盪培養7天，測定石油的殘餘濃度。
8.根據權利要求6所述的產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌在降解石油烴類有機污染物上的套用，其特徵在於，所述的牛肉膏蛋白腖培養基組成為：牛肉膏3克、蛋白腖10克、NaCl25克、瓊脂15～20克、水1升，pH7.2±0.2。
實施方式
操作內容
該發明首先提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌，命名為堀越氏芽孢桿菌（Bacillushorikoshii）H-6，菌種已於2015年1月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，（地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101）登記入冊編號為CGMCCNO.10372。
該發明所述產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌（Bacillushorikoshii）從油水淹地污染土壤中分離得到，其在細菌固體培養基上呈圓形、奶白微黃色菌落，邊緣整齊，表面光滑濕潤；將菌株H-6的部分16SrDNA序列，與GeneBank中的相關菌株Blastn比較，結果顯示菌株H-6與堀越氏芽孢桿菌Bacillushorikoshii（WST2-2）的同源性最高，達到98.4％。
該發明還提供一種產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的分離方法，該方法包括：
步驟一：在無菌條件下，將油水淹地污染土壤樣品加入到含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基中，搖床培養，得到富集培養液；
步驟二：將步驟一得到的富集培養液依次加入到含油濃度分別為0.3％、0.5％、1％和2％的無機鹽液體培養基中，搖床培養，得到富集培養液；
步驟三：將步驟二得到的富集培養液用無菌水稀釋後進行分離純化，待生長出單一菌落為止，然後對單一菌落進行篩選，得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌。
按照該發明，先在無菌條件下，將油水淹地污染土壤樣品加入到含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基中，優選是將10克油水淹地污染土壤樣品加入到100毫升含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，優選在160轉·分鐘，28～35℃搖床培養7天，得到富集培養液；所述的油水淹地污染土壤樣品優選為在油水淹地污場地採集後於4℃下冷藏的新鮮土壤。
按照該發明，在無菌條件下，將上述富集培養液加入到100毫升含油濃度為0.3％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，優選在160轉·分鐘，28～35℃搖床培養7天，然後再連續富集培養3次，每次無機鹽液體培養基中原油濃度依次遞增，分別為0.5％、1％和2％。
按照該發明，將得到的富集培養液用無菌水稀釋後進行分離純化，優選採用稀釋平板法和平板畫線法進行分離純化，具體是取富集培養液1毫升用無菌水以10倍稀釋法進行稀釋，再取1毫升塗布於含油濃度為2％的無機鹽培養基平板上，分離得到能夠以原油為唯一碳源的單一菌落，將分離到的單菌落接種到無機鹽培養基培養並保存，然後對分離到的單菌落進行篩選，具體為將分離得到的單菌株接種到血平板培養基上，篩選得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌菌株H-6。所述的血平板培養基為一次性成品培養基。
按照該發明，所述的無機培養基組成優選為：K2HPO46克、KH2PO46克、（NH4）2SO46克、MgSO4·7H202.6克、NaCl12克、CaCl2·H2O0.16克、蒸餾水1升、pH7.5±0.2。
該發明還提供上述產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌在降解石油烴類有機污染物上的套用。
按照該發明，所述的產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌用於降解石油烴類有機污染物，具體步驟優選為：
將產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌單菌株從平板挑取單菌落一環接種到裝有50毫升牛肉膏蛋白腖培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，28～35℃震盪培養18h，得到種子培養液，以石油為唯一碳源，按體積百分比為1％接種量（光密度OD600＝0.5）將種子培養液接種至100毫升含油濃度為2％的無機鹽液體培養基中，在160轉·分鐘，28～35℃震盪培養7天，石油初始濃度為2000毫克·升，測定石油的殘餘濃度。所述石油的殘餘濃度採用紫外分光光度法測定。所述的牛肉膏蛋白腖培養基組成為優選：牛肉膏3克、蛋白腖10克、NaCl25克、瓊脂15～20克、水1升，pH7.2±0.2。
實施案例
實施例1
取10克油水淹地污染土壤樣品加入到100毫升含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，30℃搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為0.3％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，30℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為0.5％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，30℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為1％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，30℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為2％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，30℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升用無菌水稀釋10倍後再取1毫升塗布於含油濃度為2％的無機鹽培養基平板上，分離得到能夠以原油為唯一碳源的單一菌落，將分離到的單菌落接種到無機鹽培養基培養並保存，將分離得到的單菌株接種到血平板培養基上，篩選得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌菌株H-6。
實施例2
取10克油水淹地污染土壤樣品加入到100毫升含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，28℃搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為0.3％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，28℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為0.5％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，28℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為1％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，28℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為2％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，28℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升用無菌水稀釋10倍後再取1毫升塗布於含油濃度為2％的無機鹽培養基平板上，分離得到能夠以原油為唯一碳源的單一菌落，將分離到的單菌落接種到無機鹽培養基培養並保存，將分離得到的單菌株接種到血平板培養基上，篩選得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌菌株H-6。
實施例3
取10克油水淹地污染土壤樣品加入到100毫升含油濃度為0.1％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，35℃搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為0.3％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，35℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為0.5％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，35℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為1％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，35℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升加入到100毫升含油濃度為2％的無機鹽液體培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，35℃繼續搖床培養7天，得到富集培養液；
取上述富集培養液1毫升用無菌水稀釋10倍後再取1毫升塗布於含油濃度為2％的無機鹽培養基平板上，分離得到能夠以原油為唯一碳源的單一菌落，將分離到的單菌落接種到無機鹽培養基培養並保存，將分離得到的單菌株接種到血平板培養基上，篩選得到產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌菌株H-6。
實施例4
將產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌單菌株從平板挑取單菌落一環接種到裝有50毫升牛肉膏蛋白腖培養基的無菌三角瓶中，在160轉·分鐘，30℃震盪培養18h，得到種子培養液，以石油為唯一碳源，按體積百分比為1％接種量（光密度OD600＝0.5）將種子培養液接種至100毫升含油濃度為2％的無機鹽液體培養基中，在160轉·分鐘，30℃震盪培養7天，石油初始濃度為2000毫克·升，測定石油的殘餘濃度。圖1為不加菌劑和該發明產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌的石油降解率對比結果圖，圖中CK為不加菌劑的對照，從圖1可以看出，該發明的堀越氏芽孢桿菌菌株H6能產生表面活性劑，對石油污染物具有良好的降解效果。
榮譽表彰
2019年10月，《產表面活性劑的堀越氏芽孢桿菌及其分離方法和套用》獲得第三屆吉林省專利獎優秀獎。
