生物毒素形態分析

生物毒素是一類具重要的生物源化學物質，具有廣泛的民用價值和軍事意義。生物毒素形態分析可以採用理化分析法、免疫學方法、高效液相色譜法等方法。

基本介紹

• 中文名：生物毒素形態分析
• 外文名：Biotoxins morphological analysis
• 拼音：shengwudusuxingtaifenxi
• 方法：理化、免疫學、高效液相色譜等
• 舉例：海洋生物毒素、真菌毒素等
• 用途：民用和軍事

生物毒素

生物毒素(biological toxins)是生物機體分泌代謝或半生物合成產生的、不可自複製的有毒化學物質，包括動物、植物、海洋生物和微生物等產生的對其它生物物種有毒害作用的各種化學物質。生物毒素的研究具有廣泛的民用價值和軍事意義。作為治療藥物、抗癌導向藥物和預防疫苗，生物毒素及其作用機理、效力等的研究尚在積極的探索之中；由於生物毒素毒性較高，可發展成為一種潛在的生物武器，對人類健康和國家安全構成了潛在的巨大威脅。因此，生物樣品和環境樣品中痕量生物毒素的檢測已成為各國關注的重點，發展毒素的檢測、鑑別和防護手段也成為當前國際反恐工作的迫切需要。生物毒素的分析檢測早期主要通過動物實驗、常規免疫方法及普通理化分析手段等進行。近年來，隨著分析技術的不斷發展，生物質譜、色譜質譜聯用和各類新型感測技術越來越多地套用於生物毒素的檢測中，使生物毒素的定性與鑑別更加準確，分析的靈敏度和特異性也有很大地提高。

海洋生物毒素——河豚毒素和石房蛤毒素

河豚毒素(tetrodotoxin, ttx)屬於小分子非蛋白質類神經性毒素，分子式c11h17n3o8，分子量319.3， ld50(半數致死量)為8 μg/kg(小鼠，ip.)，曾一度被認為是自然界中毒性最強的非蛋白類毒素。有報導稱在歐洲捕撈的海螺引發了河豚毒素中毒事件，該種屬的海螺ttx含量驚人，1隻可致10個成年人死亡。ttx不溶於有機溶劑，易溶於有機酸和無機酸水溶液，ph 3～7，對熱穩定，在強酸強鹼條件下不穩定，主要降解產物為c9鹼。
石房蛤毒素(axitoxin, stx)屬麻痹性貝毒素(psp)。它是海洋生物中毒性很高的小分子麻痹性神經毒素，小鼠ld50為8 μg/kg。其分子式為C10H17N7O4，分子量299。純品為白色固體，易溶於水，不易被消化酶破壞。石房蛤毒素主要作用於突觸前膜，可阻斷突觸後膜的Na+通道，導致一系列的中毒症狀。

生物測定法

細胞毒性法是檢測stx常用生物測定法之一，主要基於stx作為鈉通道阻斷劑對細胞生物活性的影響實現檢測。okumura等通過加入刺尾魚毒素（maitotoxin），將孵育時間從1～2 d降至6～8 h，實現了快速細胞生物分析。套用神經瘤細胞建立的psp的體外檢測模型，測得幾種psp的毒性大小為：stx > dcstx > neostx > gtx1,4 > dcneostx > gtx2,3 > dcgtx2,3 > gtx5。

理化分析法

沈曉書等在ttx的螢光檢測法中套用微波輔助鹼解法提高ttx的水解速度和c9鹼的產率。在鹼解體系中，以水和異丙醇作為混合溶劑使螢光強度得到顯著提高，該方法可檢測16 μg/l ttx。
液相色譜-質譜聯用技術(lcms)可對ttx直接進行檢測。對於全血和尿液等生物樣品，以c18或活性炭固相萃取柱對樣品進行預處理，結合液相色譜-電噴霧串級質譜(lc-ms/ms)可檢測低於10 μg/l的ttx。gc-ms方法則需將ttx降解成為c9鹼並對其進行衍生化方可檢測，檢出限(lod)可達1 ng。

免疫學方法

常規酶聯免疫吸附法(elisa)主要基於游離的ttx競爭抑制以鹼性磷酸酶(ap)標記的mab與檢測抗原的結合反應，最新報導則以鹼性磷酸酶標記ttx，通過直接競爭免疫抑制法實現對ttx的檢測，其檢測靈敏度為2 μg/l。免疫親和柱層析法通過抗原抗體的特異性結合實現ttx的捕獲和富集，親和柱上洗脫的ttx與其mab的結合產物以高效液相色譜-螢光檢測器(hplc-fld)檢測，lod為2 μg/l。
各種基於免疫學原理的新型感測器相繼用於ttx的檢測。基於表面電漿共振技術(spr)的感測器是將具有特異識別屬性的分子(即配體)固定於金屬膜表面，監控體系中被分析物與該配體特異性結合導致的金屬膜表面體系的折射率發生變化，從而實現檢測，具有無需標記，快速靈敏等優點。將ttx化學鍵合在自組裝單分子層膜(sam)修飾的金膜表面以抑制法測定定量ttx抗體與樣品中ttx結合後剩餘的ttx抗體，從而實現對ttx的定量檢測。該方法ic20(20%抑制濃度)和ic50(50%抑制濃度)處的lod分別為0.3和6 ng/l。電化學免疫感測器結合了電化學放大作用與免疫電極的特異性。在一次性絲網印刷碳電極上覆蓋bsattx包被物，然後加入游離的ttx和鹼性磷酸酶標記的ttx mab，特異性結合引起的電流變化以安培計檢測，從而間接求得ttx含量。該方法最低可檢出16 ng/l的ttx。

真菌毒素——黃麴黴毒素和t2毒素

黃麴黴毒素(aflatoxin, af)是一種雜環分子，具有強致癌力。其作用的靶器官主要為肝臟，可導致肝細胞癌變。afb1是全部黃麴黴毒素的亞型中毒性最強的，小鼠ld50為9 mg/kg，其結構穩定，耐熱能力強，是已發現真菌毒素中最穩定的一種，但易被鹼或強氧化劑破壞。
t2毒素(t2 toxin)是單端孢霉烯族毒素之一，屬a型單端孢霉烯。分子式：c24h34o9；分子量：466.2。不同種動物ld50範圍在1.0～14.0 mg/kg體重。t2毒素主要作用於增殖活躍的細胞，對淋巴細胞的損害最為嚴重。t2毒素純品為白色針狀結晶，易溶於有機溶劑，不易溶於水。其性質穩定，僅鹼性條件下次氯酸鈉可使之失去毒性；環氧基團和雙鍵被認為是活性單位。

高效液相色譜法

高效液相色譜法(hplc)是檢測真菌毒素的常用方法之一。套用螢光衍生化試劑蒽腈對t2毒素進行柱前衍生化，以免疫親和色譜柱分離，lod為5 μg/kg(穀粒)，回收率80%。氣相色譜質譜法(gc-ms)是t2毒素套用最廣泛最靈敏的檢測方法，可以同時檢測幾種不同類型的單端孢霉烯族毒素，在多種毒素混合污染時更具獨特的優越性。採用ncigcms可檢出低至1 fg的t2毒素。本實驗室對鐮狀鐮刀菌菌株產毒培養物中的有毒代謝產物採用gc-ms鑑別，並對其中的主要毒素採用單離子選擇模式進行了定量分析。以c18作為分散材料的基質固相分散法對油性基質進行預處理，無需後續處理即可去除基質中的油脂。結合lc-esi-ms/ms分析預處理後的樣品，可同時檢測4種亞型的黃麴黴毒素b1、b2、g1和g2，lod為20～90 ng/kg。

免疫學方法

免疫層析法結合了免疫的高特異性和層析法快速簡便的特點，樣品藉助毛細作用在條狀纖維製成的膜上泳動，黃麴黴毒素被固定於膜上特定區域的含有膠體金探針的抗體捕獲並富集，以纖維膜上顯色條的有無或多少來定性或定量，幾分鐘便可得到直觀結果。該金標試紙條可檢測食物中2 μg/kg的黃麴黴毒素，準確率大於95%。螢光偏振免疫測定法[16]基於毒素與抗體結合後分子質量增大，分子旋轉速度降低從而導致螢光偏振值增大的原理，螢光標記的毒素在樣品中同無螢光標記的毒素與特異性抗體競爭性結合，通過測定螢光偏振值的變化實現檢測。該方法可檢測不同穀物中低至5 μg/l的afb1，但與b2、g1和g2亞型有約30%的交叉反應。
對於海洋生物毒素和真菌毒素等小分子毒素，生物測定法、組織培養法以及薄層色譜法等由於檢測成本低，對設備要求不高等特點，在基層實驗室檢測中仍有廣泛套用。氣相、液相等色譜方法不僅在定量分析中具有較大優勢，在選用合適的檢測器(如fld)和樣品預處理方法(如柱前衍生化)後可成為檢測小分子毒素最靈敏的方法之一。色譜質譜聯用技術在定量檢測的同時可對毒素進行準確的定性鑑別，成為科研和實驗室檢測的主流方法。免疫層析法和螢光免疫法等技術將免疫檢測的高特異性與光譜法的高靈敏度或色譜法的分離、富集作用有效整合在一起，可對小分子生物毒素進行快速、準確的鑑別，成為現場快速偵檢和篩查的主要手段。

動物毒素——蛇毒

蛇毒是毒蛇的毒腺分泌的毒液中毒性成分的總稱，主要含有4類物質：酶、神經毒性多肽、神經生長因子和膜活性多肽，其中神經毒性多肽被稱為蛇毒素。新鮮的毒液呈蛋清樣粘稠液體， 弱酸性，常溫下易失活。經甲醛處理失去毒性，但仍保持其抗原性。α-銀環蛇毒素的ld50(小鼠，ip.)為0.128 mg/kg。

生物質譜法

生物質譜的優點在於能夠準確測定蛇毒蛋白的胺基酸序列，從而實現對不同種屬的蛇毒進行種間鑑別。套用基質輔助雷射解吸電離-飛行時間質譜-檢測-蛇毒蛋白，最低定量限為10 ng。以凝膠滲透色譜和反相hplc-將有效肽段從3種蛇毒中分離出來。

免疫學測定法

光學免疫分析(oia)基於spr原理，將單分子層薄膜塗在矽晶片基質表面，蛇毒與薄膜的特異性結合會導致入射白光產生金黃色至藍紫色的反射光。該方法可對血、尿等生物樣品中的4種類型的蛇毒的原型同時進行定性和半定量檢測，lod為0.2～1.6 μg/l。螢光免疫技術結合了螢光檢測的高靈敏度和免疫法的高特異性，以聚苯乙烯微球為載體，半導體量子點為螢光標記試劑，將蛇毒抗體固定於表面羧基化的具有不同顏色的微球上，加入蛇毒使之與抗體結合，再加入結合有量子點的蛇毒抗體，與蛇毒結合形成抗體-抗原-抗體複合物，實驗結果可通過紫外顯微鏡直接觀測。該方法對naja kaouthia蛇毒的lod為5～10 μg/l。