1.1毒種來源
可用Sabin株，Sabin純化株，中Ⅱ17，中Ⅲ2株。所有疫苗生產用毒株均須經衛生部批准。
毒種,疫苗製備,檢定,保存與效期,猴腎細胞脊髓灰質炎活疫苗使用說明,服用對象,用法,禁忌,注意事項,保存與運輸,
毒種
1.1毒種來源
可用Sabin株，Sabin純化株，中Ⅱ17，中Ⅲ2株。所有疫苗生產用毒株均須經衛生部批准。
1.2 毒種批
1.2.1 毒種批製備與保存
毒種批用原毒株在猴腎細胞或人二倍體細胞上製備。從原毒株算起，SabinⅠ、Ⅱ型、中Ⅱ17及中Ⅲ2型傳代次數均不得超過3代，SabinⅢ型不超過2代。所有毒種均應於-60℃以下保存。
1.2.2 毒種批檢定
每一毒種批均按A3項分批檢定（滴度不得低於6.5LogPFU/1.0ml）。
疫苗製備
生產用房應為獨立的單元，不得攜入或操作強毒株或其他病毒、致病菌。生產前，應對生產區進行消毒。
工作人員必須經過專業培訓，身體健康，並服用脊髓灰質炎活疫苗。每年生產前應進行體檢。傳染性肝炎、痢疾、活動性肺結核患者不得進入生產部門。在猴區工作的人員不得患有肺結核。
2.1 猴腎細胞製備
2.1.1 動物選擇和檢疫
用未做過其他試驗或做過本疫苗檢定的健康獼猴製備細胞培養物。所用動物隔離檢疫應不少於6周，應無結核、B病毒感染及其他急性傳染病。凡有嚴重化膿灶、贅生物以及明顯的肝、腎病理改變者不得用於製備疫苗。
2.1.2 細胞消化與培養
採用電磁攪拌或灌注法以胰蛋白酶或其他分散劑消化猴腎細胞。細胞培養瓶置37±0.5℃培養，應於9天內長成單層。每隻猴所獲細胞為一個細胞批。
可把原代猴腎細胞連續傳5代後，用於接種病毒。
2.2 病毒接種、培育與收集
細胞維持液含3.0～5.0g/L碳酸氫鈉（pH7.6～7.8）。病毒接種量為0.01～0.5MOI，種毒後置33±0.5℃培養，出現完全病變時間應在40～96小時。
病毒液按細胞批收集於大瓶中，澄清過濾。
2.3 病毒液合併或濃縮
病毒液合併或濃縮時可用0.2μm的濾膜過濾。
2.4 加氯化鎂與分批
病毒液加氯化鎂，最終濃度為1mol/L（pH6.8～7.2）即為液體疫 苗。
同日製備的病毒液為一個亞批，數個亞批組成一個疫苗批，批量一般不超過40萬ml。
2.5 分裝
半成品經檢定合格後分裝即為液體疫苗成品。
檢定
3.1 猴腎細胞外源因子檢查
3.1.1 對照細胞檢查
於接種病毒當天（0天），每批猴腎細胞留取10%～25%換維持液，作為正常細胞對照，以檢查外源因子。
該細胞瓶置33～35℃培育，觀察14天，以此期間檢查細胞病變。有疑似病毒存在者，用猴腎細胞傳代，傳代後仍有類似現象，該細胞批所制疫苗應廢棄。用於傳代的猴腎細胞應設細胞對照。
3.1.2 血吸附檢查
種毒後7天，檢查對照細胞中血吸附病毒。通常用0.2%～0.5%雞、豚鼠紅細胞（儲存於2～8℃不超過7天），分別放4～8℃、20～25℃30分鐘觀察結果，應為陰性。如血吸附可疑陽性，在同種細胞上繼續盲傳，如傳出病毒，該批細胞製備的疫苗應予廢棄。
3.1.3SV40及其他外源因子檢查
當日生產猴腎細胞批同時接種小方瓶數個做外源因子檢查，於種毒0～2天，將細胞上清混合液接種於對SV40病毒敏感的Vero細胞瓶中，混合液在培養液中的含量應不少於20%，同種細胞最少留一瓶以上不接種，作為細胞對照，觀察14天。於接種後5～8天，再把上述細胞培養的上清液盲傳一代，傳代後觀察14天。
3.2 病毒液檢查
3.2.1 外源因子檢查
樣品以脊髓灰質炎病毒型特異性抗體（該抗體不能用猴製備，免疫用抗原必須用非靈長類細胞製備）或單克隆抗體中和。中和物（可稀釋，但稀釋度不應超過1∶4）接種猴腎細胞或其他已知對SV40敏感的細胞，並留取正常細胞對照，37℃培養觀察4周。觀察到2周時，用同樣細胞再傳一代，並觀察2周。觀察期滿因其他原因剔除不能觀察的細胞瓶數不大於20%，本試驗為成立。如培養物發生病變，應查清原因。如證實該病變是由於未中和的脊髓灰質炎病毒引起的則須重試。如證實病變確係SV40或其他外源因子污染所致，並證明與病毒液有關，則該批病毒液應廢棄。
3.2.2 無菌試驗及支原體檢查
按《生物製品無菌試驗規程》進行。支原體檢查使用已證實支持需固醇和非需固醇支原體生長的液體和固體兩種培養基。
3.2.3 病毒滴定
用微量細胞病變法或空斑法在猴腎或Hep-2或其他敏感細胞上進行。培養溫度為35～36℃，病變法7天判定結果，空斑法4天判定結果。病毒滴定時應設病毒參考品。
3.2.4型特異性檢定
取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型單價或三價脊髓灰質炎病毒抗血清與等量樣品混合，置37℃中和1小時，接種猴腎、Hep-2或其他敏感細胞，7天判定結果。樣品應為單價病毒液，型別正確無誤。
3.2.5 家兔試驗
經3.2.1～3.2.4項檢定合格的樣品，每瓶等量取樣合併。如果不立即進行檢定，樣品應保存於-20℃以下。
樣品應進行獼猴皰疹病毒（B病毒）和其他病毒檢查。用體重為1.5～2.5kg的健康家兔最少5隻，每隻家兔注射的樣品量不少於10ml，用其中1ml進行皮內多點注射，其餘的進行皮下注射，觀察時間不少於3周。到期動物死亡數不得超過20%。無B病毒和其他病毒感染判為合格。
家兔在試驗24小時以後死亡，疑有B病毒感染時作屍體解剖檢查，取部分神經組織及臟器標本凍存待查。同時用腦細胞製成10%懸液，以同樣方法接種5隻家兔，證實有B病毒感染時，應終止生產並報告國家檢定當局，未採取措施防止再感染之前，不得繼續生產。
3.2.6猴體試驗
猴體神經毒力試驗可採用脊髓注射或腦內注射方法。應使用健康獼猴，體重在1.5kg以上並應符合2.1.1項規定。猴血清經1∶4稀釋後應證明不含同型病毒中和抗體。
3.2.6.1 脊髓法
（1）猴的數量
疫苗猴體試驗必須設立參考製品。評價Ⅰ、Ⅱ型疫苗及其參考製品最少應各有11隻有效猴，評價Ⅲ型疫苗應至少有18隻有效猴。數個亞批疫苗可合併作一個疫苗批進行猴體試驗，疫苗量一般不超過40萬ml。猴子的大小和性別應承受機分配各組。同型參考製品可用於測試一批以上疫苗。
有效猴系指在中樞神經系統看到脊髓灰質炎病毒引起的特異性神經元損傷的猴子。
有效猴數不足時，允許補足，但也應同時設有參考猴數。如試驗需要2個工作日，則每一個工作日用疫苗和同型參考製品接種的猴子數應相等。為了得到11隻和18隻有效猴，通常要相應地增加接種猴數。
（2）疫苗和參考製品的病毒滴度
疫苗和同型參考製品的病毒含量應調整到儘可能接近，每隻猴注射6.5～7.5LogCCID50/1.0ml，但只用一個病毒濃度接種動物。
（3）試驗觀察
全部猴子應觀察17～22天。在接種24小時後死亡猴應作屍體解剖，檢查是否因脊髓灰質炎引起的死亡。因其他原因死亡的猴子在判定時可以剔除。
在觀察期內死亡的猴數不超過20%時，試驗為成立。
呈瀕死狀態或嚴重麻痹的猴子應處死進行屍檢。
（4）檢查切片數
每隻猴子取中樞神經系統進行組織學檢查。切片厚度為10～15μm，沒食子藍染色檢查切片數如下：
腰膨大12個切面；
頸膨大10個切面；
延髓2個切面；
橋腦和小腦各1個切面；
中腦1個切面；
大腦皮層左右側和丘腦各1個切面。
（5）病毒活性的計分
為了評價腦和脊髓半個切面的病毒活性，由同一人員統一採用4級計分法判斷其病變嚴重程度。
（一）僅有細胞浸潤（這不足以認為是有效猴）；
（二）細胞浸潤伴有少量的神經元損害；
（三）細胞浸潤伴有廣泛的神經元損害；
（四）大量的神經元損害，伴有或無細胞浸潤。
切片中有神經元損害，但未見針跡者應視為有效猴。切片中由外傷引起的損害，而又無特異的病理改變則不視為有效猴。
嚴重程度的分值是由腰髓、頸髓和腦組織切片的整個切片的計分累計而成的。每隻有效猴的病變分值為：
Ls=〔腰髓分值總和/半個切片數+頸髓分值總和/半個切片數+腦分值總和/半個切片數〕÷3
再計算每組有效猴的平均分值。
（6）神經毒力試驗的評價。
參考製品的平均病變分值在上限與下限之間時，各生產單位才能根據各自的C1、C2、C3值判定疫苗合格與否，判定標準如下：
疫苗的平均病變分值（Xtest）與參考製品的平均病變分值（Xref）想比較。
合格：Xtest-Xref<C1
不合格：Xtest-xref>C2
重試：（1）C1<Xrest-Xref<C2（僅限一次）；
（2）同一次試驗中，疫苗組平均分值與參考組平均分值之差小於C1時，而疫苗組中單只猴最高分值≥2.5，並大於疫苗參考組單只猴最高分值的兩倍時，本批疫苗應重試。
重試合格：[X（test1+test2）-X（ref1+ref2）]/2<C3
重試不合格：[X（test1+test2）-X（ref1+ref2）]/2>C3
3.2.6.2 腦內法
取健康猴20隻，麻醉後在兩側視丘分別注入0.5ml樣品，不低於 7.0LogPFU/1.0ml及10-1各10隻，觀察21天。到期動物死亡數和未命中數不得超過20%，否則應補足。注射後48小時內死亡或出現非特異性麻痹症狀者剔除不計。中途死亡及到期處死動物，做中樞神經系統病理組織學檢查，判定標準如下：
合格標準：凡符合下列情況之一判為合格：
（1）中樞神經系統無脊髓灰質炎病理組織學改變；
（2）有2隻猴發生輕度及其以下病變；
（3）1隻猴發生中度及其以下病變。
不合格標準：
（1）一隻猴有中度病變，同時一隻猴有輕度以上病變者；
（2）一隻猴有重度以上病變者。
重試標準：
2個亞批疫苗合併試驗結果不合格者，可以分批重試，並按上述標準判定。
3.2.7rct特徵試驗
將單價病毒液分別在36℃及40℃溫度條件下進行病毒滴定，培養溫度差不超過±0.1℃，試驗設t+和t-樣品（生產毒種或已知對人安全的疫苗）為對照。如果被試病毒液和參考病毒在36℃的繁殖滴度比40℃的滴度高5.0Log，則rct特徵試驗合格。此外，也可進行d特徵試驗，以彌補rct特徵試驗的不足。
3.3 成品檢定
3.3.1 外觀檢查
疫苗應為橘紅色液體，澄清無異物。
3.3.2 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
3.3.3 病毒滴定
與3.2.3項相同。每人份三價疫苗病毒含量（LogCCID50或PFU/1.0ml）應≥6.15,Ⅰ型6.0，Ⅱ型5.0，Ⅲ型5.5。單價應≥5.0。
3.3.4 熱穩性定試驗
疫苗批樣品於37℃放置48小時，病毒滴度降低不得超過0.5Log。
保存與效期
於-20℃以下保存，自病毒滴定合格之日起效期為2年。2～8℃保存效期為1年。
猴腎細胞脊髓灰質炎活疫苗使用說明
服用對象
主要為2個月齡以上兒童。
用法
首次免疫從2月齡開始，第1年連續口服3次，每次2滴，每次間隔4～6周。4歲時再加強免疫1次，切勿用熱水送服。其他年齡組在需要時也可服用。
禁忌
凡發熱、患急性傳染病、免疫缺陷症、接受免疫抑制劑治療者及孕婦忌服。
注意事項
1.本品只供口服，不可注射！
2.本品系活疫苗，切勿加在熱開水或熱的食物內服用。
保存與運輸
應保存於2～8℃暗處，運輸應在冷藏條件下進行。
