牙菌斑生物膜相容性基因的篩選

《牙菌斑生物膜相容性基因的篩選》是魏世成為項目負責人，北京大學為依託單位的面上項目。

基本介紹

• 中文名：牙菌斑生物膜相容性基因的篩選
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人 ：魏世成
• 依託單位 ：北京大學

結題摘要

本項目研究內容主要包括以下兩個方面：①構建宏基因組Fosmid文庫篩選牙菌斑培養菌群抗生素耐藥基因。研究採集20例無齲健康人的集合牙菌斑並進行厭氧培養，提取牙菌斑培養菌群宏基因組構建宏基因組Fosmid文庫，用卡那黴素、四環素、氨苄青黴素三種抗生素對文庫進行篩選。對篩選到的Fosmid克隆進行Fosmid末端測序、亞克隆文庫構建、篩選、陽性亞克隆測序和序列分析。課題建立了多菌種的牙菌斑培養菌群，以該菌群基因組DNA為插入片段來源，構建了牙菌斑培養菌群宏基因組Fosmid文庫，插入片段長度在36到48kb間約有15120個克隆，插入片段長度小於36kb約有3360個克隆。從文庫中篩選到了3條具有抗生素耐藥功能的序列，分別是含有雙功能乙醯轉移酶和磷酸轉移酶基因的序列（卡那黴素耐藥）、含有四環素核糖體保護蛋白基因tet（M）的序列（四環素耐藥）和內含可誘導C組-內醯胺酶基因的序列（氨苄青黴素耐藥）。並且前兩個耐藥序列中分別含有IS256轉座酶基因和接合轉座子蛋白基因，而在氨苄青黴素耐藥序列中含有轉錄調控因子基因。研究證實了可以通過構建宏基因組Fosmid文庫的方法來篩選牙菌斑培養菌群中細菌的抗生素耐藥基因。②通過宏基因組測序分析揭示與牙周病相關的口腔微生物群落及其潛在的功能。儘管大量研究報導了某些細菌和人類口腔疾病之間的關係，但對與口腔疾病相關的微生物群落的種類、功能組成，至今缺乏系統的研究認知。本研究中，我們採用宏基因組學方法來研究與牙周健康和疾病相關的微生物群落的結構和功能，套用測序分析手段對牙周健康和患有慢性牙周病的牙菌斑樣本進行宏基因組測序，通過對代表4種牙周狀態的來自於牙周菌斑生物膜的16個樣本的基因組序列的對比分析，證實在微生物群落結構與牙周健康和疾病狀態之間存在很強的相關性，並發現了與牙周疾病相關的一組核心微生物群落。證實在牙周病微生物群落中，許多功能基因和代謝途徑過表達，其中主要涉及細菌趨化、鞭毛組裝和毒素生物合成相關的功能基因和代謝途徑。此外，通過宏基因組組裝還鑑定出一些新的物種和功能基因。本研究獲得的這些物種類群及其功能是尚未被發現的，這些新的微生物物種，尤其是新的基因，可以提供更多的線索來了解人類口腔疾病的形成和發展。因此，本研究結果豐富了我們對人類口腔微生物的理解，揭示了在人類牙菌斑生物膜及其相關的口腔疾病形成與演替過程中微生物群落的作用。

項目摘要

牙菌斑是一種典型的生物膜，其記憶體在正常菌群，細菌之間的相互作用決定牙菌斑生物膜內定植的細菌種類。細菌之間通過協同利用生態位點、營養物質、合成共生因子及信息分子等共存於牙菌斑生物膜內，相關的基因為牙菌斑生物膜相容性基因。儘管已篩選出一些參與牙菌斑生物膜形成的基因，但都是針對單菌種進行的研究，需從牙菌斑宏基因組的角度，對多菌種構成的生物膜進行全面、系統的研究。首先構建牙菌斑總基因組fosmid文庫，將文庫加至牙菌斑菌群中，分離出能與菌群共生於生物膜內、攜帶fosmid的E.coli，在篩選出的fosmid中可能含有牙菌斑生物膜相容性基因。隨後將篩出的基因插入表達質粒，轉化E.coli，通過體外生物膜形成實驗以及動物實驗，驗證基因的相容性，即基因編碼的蛋白使非牙菌斑固有菌E.coli能相容於牙菌斑菌群，共生在有限的生態位點，形成牙菌斑生物膜。將為理解牙菌斑內正常菌群的形成、細菌之間的相互作用。