《烏賊墨寡肽EPSI-1的製備與抗前列腺癌機制研究》是依託浙江海洋大學，由丁國芳擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：烏賊墨寡肽EPSI-1的製備與抗前列腺癌機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：丁國芳
- 依託單位：浙江海洋大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
前列腺癌（PCa）是全球最常見惡性腫瘤之一，一旦發生或轉移，治療效果較差，且腫瘤長期化療損害重要臟器，也會產生腫瘤耐藥。因此，尋找低毒、高效新型抗癌藥物勢在必行。在研究PCa發生、轉移及相關基因表達基礎上，近5年來，又從烏賊墨中經酶解法首次得到5種不同分子量烏賊墨多肽（EPSI），其中分子量小於1KDa的EPSI-1具有顯著誘導PCa細胞凋亡和基因調控作用。採用GE、GC、HPLC、CD和NMR等對EPSI-1進行分離純化和結構表征。對其純化物進行抗腫瘤機制研究，採用PCa細胞株和荷瘤小鼠模型進行體內外試驗，闡明PCa的p53、nm23H1、VEGF-C表達以及MVD、MLC變化，明確海洋藥物篩選和製備的關鍵技術，評價其抗PCa作用機制。本研究將製備一種新型抗PCa海洋藥物前身物，為一種具有自主智慧財產權的抗腫瘤海洋肽類藥物的研發奠定基礎。因此，具有重要的學術價值和較好的套用前景。
結題摘要
本項目以新鮮的烏賊墨為原料，進行烏賊墨寡肽和烏賊墨肽聚糖進行分離純化。烏賊墨寡肽主要是通過蛋白酶酶解獲得烏賊墨酶解物並進行分離純化，抗癌活性篩選，然後將收集的峰進行進一步分離純化。分離純化得到的寡肽進行胺基酸序列檢測。烏賊墨肽聚糖粗提物經過分離純化，並用高效液相色譜和聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測純度，得到單一組分，最後將該樣品通過紫外和紅外掃描進行結構表征。研究結果表明烏賊墨寡肽的N端胺基酸序列為：Gln-Pro-Lys，分子量為343.4。CCK-8法結果顯示，不同濃度的烏賊墨寡肽和烏賊墨肽聚糖對DU-145和PC-3細胞均有增殖抑制作用，呈劑量和時間依賴。AO/EB雙染顯示，對照組無明顯凋亡細胞，5mg/mL烏賊墨寡肽和肽聚糖組開始出現早期凋亡細胞，隨著烏賊墨寡肽和烏賊墨肽聚糖組濃度增加，晚期凋亡細胞逐漸增多，核濃聚、偏位、被染成桔紅色，可見明顯的凋亡小體。套用Annexin V-FITC/ PI 雙標記流式細胞術檢測後發現，不同濃度烏賊墨寡肽和墨肽聚糖作用24h後DU-145和PC-3早期凋亡率隨著作用藥物濃度的增加而增加。烏賊墨寡肽作用後，三種細胞中Bcl-2蛋白隨著作用濃度的增加。2種細胞中Caspase-3和Caspase-9隨著作用濃度的增加，陽性表達增加。烏賊墨寡肽以10mg/mL作用於DU-145和PC-3細胞24h後，兩種細胞中p53mRNA表達量增加；兩種細胞中BRCA1mRNA表達量增加。細胞周期結果顯示寡肽將DU-145細胞阻滯在S期和G2/M期;；PC-3細胞被阻滯在G0/G1期和SubG1期。免疫組化法檢測肽聚糖作用前後結果表明，烏賊墨肽聚糖對DU-145和PC-3細胞作用24h後，COX-2和VEGF蛋白表達急劇下降，陽性表達減弱。原位雜交方法結果表明，以15mg/mL肽聚糖作用於DU-145和PC-3細胞24h後，兩種細胞中Bcl-2mRNA表達量下降；Caspase-3 mRNA表達量增加。建立小鼠PC-3細胞移植瘤模型，結果表明烏賊墨肽聚糖低、中和高劑量組對PC-3移植瘤均有抑制作用，抑瘤率分別為7.81%、23.43%和35.36%。急性毒理試驗結果發現，烏賊墨肽聚糖實驗組小鼠最大給藥量為21.00g/kg.d，且試驗過程中沒有小鼠死亡。
