準種

準種的概念最初是在研究地球上早期生命進化時針對相關而不同的核酸克隆而提出的。後來在研究噬菌體Qβ的RNA時發現，所謂的“野生型“Qβ噬菌體僅占15%，其餘85%均是不同的變異株，而且在體外複製的Qβ噬菌體變異株RNA也具有異質性。由此將準種的概念引入病毒學。RNA病毒基因組的突變率，是每個複製周期、每個位點有10^-3～10^-5個核苷酸替換。在宿主的選擇壓力作用下，將產生許多突變株，其中有一個或幾個占優勢的突變株，叫做病毒的準種。

基本介紹

• 中文名：準種
• 外文名：quasispecies
• 最初提出：針對相關而不同的核酸克隆
• 發現：研究噬菌體Qβ的RNA
• 學科：病毒學
• 本質：優勢突變株

準種的簡介

1971年Manfred Eigen在研究大分子進化模型時第1次提出病毒準種的概念。隨著遺傳學、生化學、免疫學等塒病毒研究的不斷深入，尤其是對RNA病毒的變異率、基因重組、免疫逃避等的深入了解，準種的概念逐漸完善。日前，病毒學家公認的病毒準種概念如下：

病毒準種是受遺傳變異、競爭及選擇作用影響的高度相關但不完全相同的變異株和重組基因組組成的動態種群。這一概念強調準種遺傳學上既高度相關又不完全相同，且準種處於不斷變化之中，影響準種變化的因素主要是遺傳變異、競爭性生長及選擇作用。選擇作用是準種進化的主要動力，這裡體現了準種概念與達爾文進化論的結合。

植物病毒種群的準種結構特徵

準種被定義為一個種群內各變異體圍繞著一個或幾個優勢序列的均衡分布。病毒是複雜的、動態分布的，是一致的順序、自我連續的整體，類似於集中在原有的序列上的一朵雲，這個雲就是準種。植物病毒的準種是由一個優勢基因型和一系列占很小比例的相關變異體組成。準種中的各種序列變異類型的組成和比例都是一些可能的生物學和進化功能的暗示。在進化過程中，準種中比例很小的序列類型在特定選擇壓力下也可能變為主要序列變異類型。因此保持一個大的準種變異水平可以使病毒在選擇壓力下，變成有選擇性優勢的病毒類型。

最常用於植物病毒準種遺傳結構特徵分析的方法是將適應於某一特定寄主的病毒在不同寄主或不同抗性水平或類型的品種上分別連續傳遞，由於寄主適應性或瓶頸效應的改變導致了病毒準種遺傳結構的變化。如植物寄主種類的改變或經昆蟲介體連續傳播後會導致柑橘速衰病毒、玉米線條病毒、葡萄扇葉病毒及小麥線條花葉病毒準種遺傳結構的變化。

植物病毒所具有的準種結構是作物品種抗性喪失的主要原因之一。如將MSV通過摩擦接種連續傳遞到抗性品種上後，會得到一個致病力較強的分離物，可能是病毒準種在耐病的環境中，新的突變有較強的適應能力。這種在同一分離物內不同致病型的序列變異類型共存的現象已在甜菜曲頂病毒及李痘病毒中被報導過。

Schneider和Roossinck首先對植物病毒的準種變異特徵進行了系統研究。將菸草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和豇豆退綠斑駁病毒(CCMV)這3種具有共同進化聯繫的病毒侵染同種寄主植物後分別分析其準種變異水平，結果發現這3種病毒準種變異水平與其寄主範圍是相對應的。這表明病毒的準種特徵具有重要的進化暗示，如黃瓜花葉病毒準種的高度多樣性可以使其較易地適應新的選擇壓力進入新的生境，造成更大的危害。這說明，病毒的準種變異水平是由病毒與寄主互作控制的。

肝炎病毒準種的研究及臨床意義

準種的研究方法

(一)克隆法

1、克隆+RFLP：將病毒的某一段基因序列進行PCR擴增，然後進行T載體克隆，儘可能獲得較多的克隆，對克隆質粒可以進行限制性內切酶列酶切，得到不同長度的DNA片段即限制性片段長度多態性(RFLP)，不同的準種有不同的RFLP圖譜。解放軍302醫院研究HBVS基因的準種情況，設計S基因的特異引物，擴增獲得1400bp的DNA片段，將這一DNA片段克隆到T載體中，獲得了近30個克隆，以EcoRI/XhoI進行酶切，結果發現每一例病人中至少5種以上的RFLP表現形式，即5種以上的準種存在。

2、克隆+序列分析：將病毒的某一段基因序列進行PCR擴增，然後進行T載體克隆，儘可能獲得較多的克隆，對克隆質粒可以進行序列分析，直接得到DNA的核苷酸序列。

(二)單鏈構像多態性分析(sscp)

套用非對稱PCP，獲得單股DNA，然後分析單股DNA在非變性凝膠中的電泳速度。在特定條件下，DNA片段的電泳速度由其構像所決定。病毒基因組的每一變異導致結構的改變，因此在電泳時各變異株的電泳速度不同，可在凝膠上出現不同的條帶，每一個條帶代表一個準種。此法相對簡單，能測出群體中大於5%的準種。日本學者Entomoto首先用此法研究HCV的準種，己成為分析HCV準種的最主要的手段之一。

(三)異源雙鏈凝膠轉移分析法

其方法是：PCR特異擴增目的序列，製備探針並標記，探針與同源序列雜交做參照，探針與異源序列雜交作電泳分析，最後放射自顯影觀察結果。

(四)溫度梯度凝膠電泳法：

HCVRNA經RT—PCR擴增後獲得其DNA鏈，其間可形成雜合子，此種雜合子又稱異種複製子，它是一個由野毒株序列和一個或二個變異株序列所組成，這些雜交子含有錯配子。由於錯配導致雜交子的穩定性下降，因此在溫度梯度凝膠電泳時，雜交子在特定的位點融化。不同的變異株在RT—PCR過程中形成不同的雜交子，而不同的雜交子的穩定性各不相同，從而導致各變異株不同的電泳特點。

B肝病毒準種的研究進展

儘管HBV屬於DNA病毒，但HBV複製過程中存在RNA複製中間子，HBVDNA多聚酶具有逆轉錄酶的活性而缺乏校正功能，使HBVRNA中間體逆轉錄為DNA的過程中出現錯配，導致HBV準種的產生。發現HBVS，C，X及S基因均可發生核苷酸錯配，因此HBV準種複雜而繁多。S基因的突變可以導致HBsAg抗原決定蔟發生改變，出現HBsAg陰性的HBV感染，或出現截短性HbsAg，這種截短性HBsAg具有反式激活功能。HBVC基因的突變導致HBeAg的缺失，或HBcAg的產生不完整，這些都導致HBV的清除障礙，造成HBV的持續感染，可能是B型肝炎慢性化的原因之一。HBVX基因的表達產物是HBX蛋白，該蛋白具反式激活作用，與HBV致肝細胞癌密切相關。HBX基因同樣有準種存在。劉妍等的研究顯示兩例HBV感染者的7個克隆中有5個克隆出現缺失突變，7個克隆均存在點突變。進一步研究顯HBX基因的缺失突變(8-20bp)者其反式激活作用降低，但在HBV致病作用的影響如何仍不清楚。HBVP基因準種的存在可能影響DNA多聚酶的活性，也可能影響藥物的療效，拉米夫定治療後部分患者出現YMDD變異，影響拉米夫定的效果就是一個典型的例子。

B肝病毒準種的研究的生物學意義

1、HBV基因的準種研究發現了HBV基因存在各種不同類型的基因突變，包括缺失突變，插入突變，鹼基顛換突變等，這些突變存在HBV各種不同的基因中，對HBV的發病機制有了更深入的了解。

2、HBV基因準種的研究有利於對HBV全序列的重新認識。GenBank收錄的HBV全序列有200多株，但這些都是分段克隆的，然後根據重疊部分的序列，人工拼接完成HBVDNA的核苷酸全序列。由於HBV準種的存在，這些拼接完成HBVDNA的核苷酸全序列可能來自不同的準種，因此可能在自然界並不存在。要想得到這種自然界存在的HBVDNA全序列，只有通過設計特異性引物，做長距離的PCR擴增，一次性獲得全長的HBVDNA，這才是自然界存在的HBVDNA序列。

3、HBV基因準種的研究有助於研究和了解HBVDNA形成的原因及與臨床表現和轉歸之間的相互關係。機體的免疫壓力及抗病毒藥物的選擇壓力在HBV準種形成過程中的地位和作用，HBVDNA準種的形成與急性HBV感染的慢性化，慢性HBV感染的臨床轉歸之間的關係等。

4、HBV準種的研究對於HBV防治研究的未來將產生不可估量的影響。HBV準種的變化以及某些準種在某些特定人群成為優勢種群會給HBV的防治帶來嚴重影響，以往的檢測手段不再有效，獻血員的篩選不再有效，輸血的安全性受到威脅；根據HBV流行株構建的基因疫苗的免疫預防的覆蓋率將會漸漸縮小，免疫預防不再保護大部分易感人群；抗病毒治療有效藥物的篩選的結果使抗藥病毒株成為優勢種群，常規的抗病毒藥物不再有效，那時HBV的防治將更加困難。因此必須加緊對HBV準種的研究。

C型肝炎病毒準種研究的現狀

HCV準種的研究已涉及HCV基因的各個區，連最保守的5’NC也發現有準種存在。

1、5’NC區：Martell等研究肝移植患者移植前後HCV的準種變化，發現此區儘管保守，但移植前後皆呈準種分布，移植後準種數量下降。由於此區是HCV的複製起點，含有內源性核糖體進入位點（1RES），此區的變異是激活還是抑制HCV的複製值得進一步研究。

2、C區：Kurosald等用SSCP分析C區也呈準種分布。在HCV慢性感染者，準種數目及變異度皆不斷變化。ALT高者變化更明顯。Hayashi等研究HCV慢性者C區變化時發現肝功能正常組C區變異較低且多為同義突變，而肝功能異常組則變異率高，推測C區變異與肝功能異常關係密切。Christie等研究發現，C區能引起人體細胞免疫反應，存在細胞毒性T細胞(CTL)的攻擊表位，CTL之所以不能清除病毒，C區存在不同的準種現象可能是原因之一。

3、高變區(HVR)：HCV高變區包括HVR1和HVR2，位於包膜蛋白E2區。對HVR1區研究發現，此區有能誘導出中和抗體的表位，在體液免疫的強大壓力下不斷變異，逃避免疫監視。Shimizu等動態觀察一慢性HCV感染患者14年，發現其感染後產生的杭體可中和當時的病毒，但5年後此抗體不再能中和變異病毒，血液中這種抗體漸漸消失，新的株特異性抗體出現。HVR1和HVR2可能是T細胞免疫攻擊的主要靶抗原表位，該部位變異大，感染後極易發生免疫逃避，造成HCV持續感染。

4、NS5A區；Enomoto等報告在1b型HCVNS5A區有一個干擾素敏感性決定區(1SDR)，當該區發生變異時，可產生對於擾素敏感的變異株。

5、NS5B區：此區編碼RNA多聚酶。Nelson等對40例患者進行研究，發現此區相對保守，75%的突變為同義突變，這些突變與RNA聚合酶的活性有無關係需要進一步研究。