《活性黃嘌呤氧化酶的體內源頭輔助裝配研究》是依託清華大學，由王成華擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：活性黃嘌呤氧化酶的體內源頭輔助裝配研究
- 依託單位：清華大學
- 項目負責人：王成華
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是一種在臨床診斷、核苷類藥物合成和有機污染物降解等領域具有重要套用的氧化還原酶類，但是目前生產方法仍然存在著裝配效率低下、活性態XOD與非活性態及其前體蛋白混雜的問題需要解決。本項目擬採用體內源頭輔助裝配的思路，通過強化XOD氧化還原中心組裝和向活性態轉變過程，重點解決高效裝配高活性XOD這一關鍵問題。分別從輔助活性態硫化鉬蝶呤輔基的形成及其組裝為活性前體蛋白、輔助二硫鍵形成促使前體蛋白向活性XOD的可逆轉變和體內分段合成酶蛋白促使不可逆轉變三個方面進行研究，以期構建在大腸桿菌體內高效表達高活性藤黃節桿菌XOD的細胞工廠。本項目的實施，可望建立高效生產高活性XOD的調控策略，並為實現基因工程法生產商品化XOD打下基礎。因此，具有重要的科學意義和套用價值。
結題摘要
黃嘌呤脫氫酶（XDH）及其翻譯後修飾形成的黃嘌呤氧化酶（XOD），分別以NAD和O2為電子受體，催化氧化嘌呤、含氮雜環分子和醛類等多種物質，因此可被用於基礎醫學研究、臨床診斷、核苷類藥物和有機污染物降解等領域。然而，作為一種包含[2Fe-2S]簇、FAD和硫化鉬蝶呤三種輔因子的複雜氧化還原酶類，目前XDH/XOD的生產仍然存在酶活低、裝配效率低、活性態XOD與非活性態及其前體蛋白混雜的問題需要解決。本項目從以下三個方面開展研究：（1）基因探礦方法挖掘新型高活性XDH基因；（2）基於體內源頭輔助裝配的思路，通過強化XDH氧化還原中心組裝和向活性態轉變過程、構建高效裝配高活性XDH的大腸桿菌細胞工廠；（3）基於電子受體區域改造構建適於一步法生產的新型XOD。首先，挖掘獲取的新型鹼性Acinetobacter baumannii XDH，對黃嘌呤的Km和kcat值分別為25.3 μM和69.3 s-1，對應的催化效率（kcat/Km）為2.74 μM-1s-1，優於已報導天然XDH。以野生型Rhodobacter capsulatus XDH（RcXDH）為實驗材料，以基因簇形式在體內獨立表達其[2Fe-2S]簇和FAD結構域編碼區域，獲取了新型(αβγ)2型XDH，耐溫性提高11℃，轉化數和催化效率分別提高1.15倍和1.66倍，達200.08±4.29 s-1和3.64 s-1μM-1，是迄今為止報導最高值。其次，輔助蛋白NifS、IscS和DsbB的過表達將RcXDH粗酶液的比酶活提高30%、94%和49%；組合表達NarJ和IscS的細胞工廠將單位菌體酶活提高1.29倍，菌體量提高1.14倍，總酶活提高3.9倍。粗酶液具有與純化酶液幾乎相同的電子傳遞和產物生成的偶聯效率，表明氧化還原中心的完整性和組裝的高效性，為建立新型高效生產高活性XDH的方法奠定了基礎。最後，通過重構RcXDH電子受體區域中FAD結合部位及結合NAD的Loop區，獲取了三個突變體，S362A、 F270L和D358 insert，氧化酶活性分別提高122倍、63倍和2125倍。同時，選取耐輻射球菌尿酸酶轉錄調控蛋白，構建了將尿酸濃度信號轉化為綠色螢光信號的尿酸生物感測器，基於轉錄蛋白（OxyR）最佳化建立了大腸桿菌體內檢測H2O2的全細胞生物感測器，為XOD/XDH的定向進化提供了工具。
