《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》是中國農業科學院油料作物研究所於2009年8月7日申請的專利，該專利的申請號為200910063481X，公布號為CN101988118A，授權公布日為2011年3月23日，發明人是王漢中、華瑋、劉靜、劉貴華、王新發、楊慶、孫美玉、黃順謀。
《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》公開了一種油菜含油量性狀主效基因位點及套用，步驟包括：1）利用高低含油量組合zy036（51％）和Y817（35％）雜交獲得含油量性狀分離的F2代群體；2）利用親本篩選多態性引物，通過在F2代分離群體中的分布構建遺傳圖譜，根據F2群體的含油量數據獲得含油量性狀緊密連鎖的分子標記並得到主效基因位點。該發明公開了同一連鎖群上兩個控制油菜zy036高含油量性狀主效基因位點BnOCN22-1和BnOCN22-2，同時公開了與主效基因位點緊密連鎖的2個分子標記。通過緊密連鎖的分子標記檢測zy036及其衍生品種（系）中是否含有該主效QTL位點，可預測其含油量高低，大大提高了含油量育種的選擇效率。
2016年12月7日，《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：油菜含油量性狀主效基因位點及套用
- 公布號：CN101988118A
- 授權日：2011年3月23日
- 申請號：200910063481X
- 申請日：2009年8月7日
- 申請人：中國農業科學院油料作物研究所
- 地址：湖北省武漢市武昌區徐東二路2號
- 發明人：王漢中、華瑋、劉靜、劉貴華、王新發、楊慶、孫美玉、黃順謀
- Int.Cl.：C12Q1/68(2006.01)I、C12N15/11(2006.01)I、A01H1/04(2006.01)I
- 代理機構：武漢宇晨專利事務所
- 代理人：王敏鋒
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
作為世界四大油料作物之一，油菜生產對保障中國食用植物油脂和飼用蛋白質的有效供給，對改善食物結構，促進養殖業和加工業發展等諸方面均有重要影響。雖然中國油菜種植面積和產量均居世界第一，但遠不能滿足國內的消費需求，63％左右的食用植物油依賴進口。隨著人口數量的增長和人民生活水平的提高，預計到2010年中國食用植物油消費量將增加到2,500萬噸，按2009年前的生產規模，缺口將更加巨大。儘管油料市場需求如此，農民種植油菜的積極性卻不高。造成這種局面的主要原因之一是中國的油菜籽比主要出口國加拿大生產的油菜籽含油量5個百分點左右，且成本高，市場競爭力相對較弱。因此，從保障食物油供給安全和增加農民收入的角度考慮，較大幅度增加單位面積菜籽油的產出量是解決2009年前狀況的對策之一。
中國油菜研究和育種工作具有較深厚的基礎，一些領域處於世界領先地位。油菜高油分育種的途徑主要有多世代的單株選擇、種間雜交、黃籽油菜育種和誘變選育。
截至2009年8月，隨著基因組學研究取得一系列突破，以分子標記選擇、轉基因和品種分子設計為代表的分子育種技術的成功套用，大大提高了作物遺傳育種水平。與常規育種相比，該技術可以通過分析與目標性狀基因緊密連鎖的分子標記判斷目的基因的存在與否，並進行精細定位。同時，利用分子標記進行輔助選擇育種，減少了盲目性，縮短育種年限，大大提高了選擇效率。分子標記輔助選擇育種技術的關鍵是與重要農藝性狀緊密連鎖的DNA分子標記的鑑定。美國、日本、西歐各國等國家近年都投入巨資開展這方面的工作。伴隨著水稻，小麥、玉米、棉花、大豆等重要作物的一些農藝性狀的分子標記的開發，利用鑑定到的分子標記進行輔助選擇育種主要包括種質資源的鑑定、基因定位、基因累加或聚合、異源目的基因的篩選和鑑定以及遺傳圖譜的構建等，育種目標包括抗病、抗蟲、抗旱、高產、品質改良等各個方面。隨著生物技術的發展，油菜分子標記的研究日漸受到關注，研究的領域涉及遺傳圖譜的構建、基因標記和基因定位、親緣關係分析、品種純度鑑定、標記輔助選擇等多方面，並取得了重要進展。但與已開發國家相比，中國的油菜分子育種研究工作還有較大差距，主要體現在：不能有效地發掘和利用種質資源中的有利基因，缺乏有自主智慧財產權及育種價值的基因和標記等。
2009年前常用的分子標記技術大致可分為兩種，一種是基於southern雜交技術，另一種則以PCR技術為核心。Grodzicker等（1974）創立了限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）標記技術。Botstein等（1980）首先提出用限制性片段長度多態性（restriction fragment lengthpolymor phism，簡稱RFLP）作為遺傳標記構建遺傳圖譜的構想，從而開創了利用分子標記作為遺傳標記的新時期。隨後幾十種基於Southern雜交或聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的DNA分子標記技術陸續建立，這些DNA分子標記所檢測的多態性在基因組的位置大多為隨機分布，因此可以通稱為隨機DNA分子標記（ran dom DNA markers，RDMs）。RDMs的發展大大提高了人們對基因組多樣性、遺傳作圖等的研究效率，並廣泛的套用於植物科學的研究中。
大多數重要的農藝性狀均表現數量性狀的遺傳特點，如產量性狀、成熟期、品質、抗旱性等。數量性狀易受環境條件的影響，因此選擇效果不好。傳統育種方法周期長，主要是由數量性狀造成的。由於分子標記技術的發展，人們已可將複雜的數量性狀進行分解，象研究質量性狀基因一樣對控制數量性狀的多個基因進行研究。QTL是在高密度的遺傳圖譜基礎上，通過一定實驗設計，獲得分子標記，藉助Mapmarker軟體分析確定控制某一性狀的基因在染色體上的位置。當目標性狀由少數幾個基因控制時用標記選擇，對發掘遺傳潛力非常有效。
2009年前對油菜種子含油量的QTL定位研究也有一些報導，通常檢測出的QTL數目較多，但效應值較小，較難在油菜育種中套用。該研究通過遺傳分析及QTL定位，旨在篩選對種子含油量具有正向效應的QTL，用於油菜含油量的標記輔助選擇。
發明內容
專利目的
《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》的目的是在於提供了一種油菜含油量性狀的兩個主效基因位點。主效基因位點不但有助於深入了解zy036品系中含油量QTL位點的作用和分布，同時為今後主效基因的克隆提供了一定的基礎。
《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》的另一個目的在於提供了一種油菜含油量性狀兩個主效基因位點緊密連鎖的分子標記。與含油量緊密連鎖的分子標記對今後zy036及其衍生品系的含油量性狀育種提供了極大的便利。
《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》的再一個目的是在於提供了一種油菜含油量性狀的主效基因位點BnOCN22-1在油菜高含油量性狀育種中的套用。
《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》的還一個目的是在於提供了一種油菜含油量性狀的主效基因位點BnOCN22-2在油菜高含油量性狀育種中的套用。
技術方案
一種油菜含油量性狀主效基因位點的發掘方法包括如下步驟：
a）利用油菜高低含油量組合zy036（51％）和Y817（35％）進行雜交，F1代自交產生F2代分離群體；
b）提取親本zy036和Y817、F1代及F2代分離群體的葉片總DNA，過程中所用到的試劑包括CTAB提取液（0.2MTris-Cl，0.25NaCl，25mMEDTA，0.5％（質量比）SDS，pH7.5）、氯仿、異戊醇、無水乙醇；
c）蒐集油菜SSR標記公開資料庫（http://www.ukcrop.net/BrassicaDB）並自主開發SSR標記、含油量相關的基因標記，利用親本篩選多態性引物。過程中所用到的主要試劑包括Taq酶、dNTP、丙烯醯胺、尿素、冰醋酸、AgN03等；
d）通過在F2代分離群體中的分布構建遺傳圖譜，藉助含油量數據進行QTL位點分析，並得到與含油量性狀主效基因緊密連鎖的SSR標記或者含油量相關的基因標記，得到了BnOCN22-1和BnOCN22-2。過程中所用到的主要軟體包括Joinmap3.0、WinQTLcart4.0（商業途徑獲得）。
該研究中所用的親本材料為含油量相差近15個百分點的zy036（51％）和Y817（35％），均由中國農科院油料所生物技術育種課題組技術人員在王漢中研究員帶領下育成。zy036品系是由中雙4號、中雙7號、中雙9號、華雙3號、油研9號構建輪迴選擇群體，輪迴選擇兩代後選優良單株進行小孢子培養輪迴選擇第三代，最終經高油定向選擇得到（所有權歸該課題組所有）。Y817是雜交品種中油雜1號的保持系（中油雜一號制種技術研究與套用，農村經濟與科技，2001年第10期）。油菜兩親本、F1及F2分離群體單株含油量的測定由近紅外分析儀完成，植物葉片總DNA的提取、PCR及聚丙烯醯胺凝膠電泳均為常用的分子生物學技術，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989），或Draper等人（Blackwell科學出版社，1988）所述的條件進行。實驗過程中涉及的所有試劑成分如均可從商業途徑獲得，並按照實驗手冊中的條件或所用試劑製造廠商所建議的條件使用。
利用上述技術措施，申請人最終獲得了含油量性狀相關兩個主效基因位點，具體如下：
BnOCN22-1，該主效基因位點位於第22連鎖群，由BN6A2-1（自主開發SSR標記）定位，其引物序列為BN6A2-1F：CTTTGTGTGGACTTTTAGAACTTTA，BN6A2-1R：CGCAGCTTTTGGCCCACCTG。利用Joinmap3.0軟體分析測得與含油量性狀不相關的機率P值為0.000，貢獻率為12.39％；
BnOCN22-2，該主效基因位點位於第22連鎖群，由標記Oa55-1（自主開發基因標記）定位，其引物序列分別為：Oa55-1F：GGTTCCAAAGGAAGGAATGCC，Oa55-1R：CCGACCAAACAGGATACAAC。利用Joinmap3.0軟體分析測得與含油量性狀不相關的機率P值為0.000，貢獻率為8.46％。
含油量主效位點BnOCN22-1和BnOCN22-2在油菜含油量育種中的套用：
利用中油036高油品系與另一抗倒伏高產但含油量僅為38％左右的品系雜交後種植F2代，在F2代苗期利用BnOCN22-1和BnOCN22-2兩位點的分子標記BN6A2-1和Oa55-1引物進行分子鑑定。種子收穫後的含油量測試結果表明，通過分子標記輔助選擇得到的植株含油量超過45％的占57％。在保留下來的植株中再藉助抗倒儀和測千粒重的方法篩選抗倒伏高產的株系。通過鑑定上述主效基因位點來預測油菜種子含油量，可迅速提高油菜高含油量品種的育種進程。
改善效果
《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》首次定位了油菜品系zy036中的2個影響含油量性狀主效基因位點，它們可共同解釋含油量20％的變化，使得油菜含油量性狀主效基因位點的定位工作居於同領域前列。傳統育種方法中，表型鑑定要等到收穫種子測定含油量，且受環境影響較大。因此含油量育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測含油量性狀主效QTL位點，可以在苗期進行淘汰，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率。《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》中含油量主效基因位點位置明確，主效基因位點的檢測方便快速，不受環境影響。通過檢測與含油量性狀相關的分子標記，即可以預測含油量的高低，進而可以快速篩選高含油量株系用於油菜含油量育種，輔助育種選擇目標明確，節約成本。
附圖說明
圖1是武漢F2群體含油量分布圖。結果表明含油量表現分布呈連續性分布，變異分布呈常態分配，且變異範圍很寬，證明含油量屬於數量性狀。
圖2是位於第22連鎖群上的QTL位點。圖中*號表示分別為第22條連鎖群上的BnOCN22-1和BnOCN22-2兩個主效基因位點，其中BnOCN22-2的連鎖分子標記為IFLP標記，BnOCN22-1為SSR標記。
圖3為BnOCN22-1和BnOCN22-2兩個含油量性狀主效基因位點的分析。
圖4是分子標記markerOa55-1在F2代株系中的篩選。圖中1、2、5、8號為高含油量株系。
技術領域
《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》屬於分子生物學及遺傳育種技術領域。更具體涉及一種油菜含油量性狀主效基因位點及主效基因位點緊密連鎖的分子標記，同時還涉及分子標記在油菜含油量育種中的套用。
權利要求
1.一種分離油菜含油量性狀的基因位點特徵在於：BnOCN22-1主效基因位點位於第22連鎖群，主效基因位點為BN6A2-1，其引物序列為BN6A2-1F：CTTTGTGTGGACTTTTAGAACTTTA，BN6A2-1R：CGCAGCTTTTGGCCCACCTG。
2.一種分離油菜含油量性狀的基因位點，其特徵在於：BnOCN22-2主效基因位點位於第22連鎖群，標記主效基因位點為Oa55-1，其引物序列分別為：Oa55-1F：GGTTCCAAAGGAAGGAATGCC，Oa55-1R：CCGACCAAACAGGATACAAC。
3.權利要求1所述的一種油菜含油量性狀的主效基因位點BnOCN22-1在油菜高含油量性狀育種中的套用。
4.權利要求2所述的一種油菜含油量性狀的主效基因位點BnOCN22-2在油菜高含油量性狀育種中的套用。
實施方式
通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989），或Draper等人（Blackwell科學出版社，1988）所述的條件，或按照所用試劑製造廠商所建議的條件。
- 實施例1 高低含油量油菜品系組合F2分離群體的構建及含油量的測定
該實施例中使用的群體為高低含油量親本（含油量分別為51％的zy036和35％的Y817）雜交後代--F2代。親本、F1及F2種子含油量由近紅外分析儀測定。F2代分離群體含油量數據分布結果表明含油量表現分布呈連續性分布，變異分布呈常態分配，且變異範圍很寬，證明含油量屬於數量性狀（圖1）。
- 實施例2 親本、F1及F2分離群體葉片總DNA的提取
利用CTAB法提取葉片總DNA，具體步驟如下：
A.適量葉片樣品取自超低溫冰櫃（-70℃），立即放入冰凍過的研缽中，加入液氮研磨成粉狀；快速裝入50毫升離心管中，加入在60℃的水浴鍋中預熱過的提取液（0.2MTris-Cl，0.25NaCl，25mMEDTA，0.5％（質量比）SDS，pH7.5），混合均勻，放入60℃的水浴鍋中水浴40分鐘；
B.取出離心管，加入等體積氯仿:異戊醇（24:1，V/V），緩慢上下顛倒離心管30-50次，使充分混勻，1300克離心10分鐘；
C.取上清於另一離心管中，加入等體積氯仿:異戊醇（24:1，V/V），重新抽提一次。取上清加入0.6倍體積冰冷異戊醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉澱集結為止。靜止30分鐘，挑出沉澱，70％（體積比）酒精洗2-3次，無水乙醇洗一次，乾燥後加無菌水65℃20分鐘溶解；
D.再次加入等體積氯仿:異戊醇（24:1，V/V），重新抽提。取上清，加入0.1倍NaAc（3摩爾/升，pH5.2），混勻後緩慢加入2倍體積的冰無水乙醇，靜止5分鐘後緩慢轉動離心管直至絮狀沉澱出現，挑出沉澱轉入1.5毫升離心管中，70％（體積比）酒精洗2-3次，無水乙醇洗一次，乾燥後加無菌水溶解，於-20℃冰櫃中保存備用。
- 實施例3 引物的開發及多態性的篩選
根據已報導的SSR標記引物以及自主開發的含油量相關的功能基因設計的分子標記進行引物的篩選。篩選結果表明，有180對引物在雙親間有差異。多態性篩選程式如下：
（1）自父母本中各隨機選擇5株的DNA模板等量混合，構成兩個親本的DNA樣本用來篩選引物。
（2）PCR體系及程式：
10×buffer（MgCl2 free） | 1微升 |
dNTPs mixture（10mM） | 0.2微升 |
Left primer（50納克/微升） | 1微升 |
Right primer（50納克/微升） | 1微升 |
Taq polymerase（5U/微升） | 0.1微升 |
MgCl2（25mM） | 0.8微升 |
油菜總 DNA | 2微升 |
ddH2o | 5.9微升 |
total | 10微升 |
PCR反應程式：
PCR | 反應程式 |
94℃ | 4分鐘 |
94℃ | 30秒 |
60℃ | 30秒 |
72℃ | 1分鐘 10cycles（-0.5℃/cycle） |
94℃ | 30秒 |
55℃ | 30秒 |
72℃ | 1分鐘 30cycles |
72℃ | 5分鐘 |
（3）凝膠電泳
試劑配製：
6％（質量比）PAGE膠：6％（質量比）丙烯醯胺，7摩爾/升尿素，0.5×TBE緩衝液，灌膠前加入300微升10％（質量比）NH4S2O4，30微升TEMED；10×TBE：Tris-base108g，硼酸55克，0.5MEDTA（pH8.0）40毫升，定容至1000毫升.使用時稀釋為0.5×TBE工作液。
PAGE膠製備：
膠板用10％（質量比）NaOH溶液浸泡24小時，洗淨，涼乾。長膠板用餐巾紙均勻塗抹反矽烷化劑（AMMMRESCO），短膠板塗抹1毫升矽烷化劑{0.5％（體積比）冰醋酸，1.5毫升95％（體積比）乙醇，1-2微升矽烷化劑}，放置5分鐘後，用95％（體積比）的乙醇輕輕洗擦以除去多餘的反矽烷化劑和矽烷化劑。將玻璃裝好，並以邊條隔開，小心套入制膠夾（GIBCO/BRL）中。準備就緒後在短膠板上用注射器將50毫升（長膠板80毫升）變性膠混合液，緩慢注入，以免產生氣泡。插入梳子，並用夾子夾牢，凝聚2小時後即可電泳。
電泳：
從制膠夾中取出膠板，擦淨玻璃外側，固定於電泳槽上，上下槽各加500毫升0.5×TBE緩衝液，將梳子拔出後立即沖洗點樣孔，接通電源1500伏恆壓預熱30分鐘。在PCR產物中加入等體積的上樣緩衝液[98％（體積比）去離子甲醯胺，10毫摩爾/升EDTA，0.005％（質量比）二甲苯青FF，0.005％（質量比）溴酚藍]，95℃變性5分鐘，冰浴冷卻，上樣5微升，1800伏恆壓電泳80分鐘。當二甲苯青FF到達2/3膠板時停止電泳。
染色：
採用銀染法進行染色：10％（體積比）冰醋酸固定至膠板無色，ddH2O漂洗兩次，每次2-3分鐘。然後染色0.1AgNO3，0.56％甲醛（體積比）30分鐘。取出膠板，在ddH2O漂洗10秒，再在預冷（4℃）的顯影液[3％（質量比）Na2CO3，0.56（體積比）％HCHO，2毫克/升Na2S2O3·5H2O]中輕輕搖動至條帶清晰可見，然後倒入中止液[10％（體積比）冰乙酸]中，停止顯影。用蒸餾水漂洗3分鐘，室溫（20-25℃以下相同）下自然涼乾，拍照保存。
- 實施例4 多態性引物在F2群體中的分布及連鎖性分析
在親本中篩選到有多態性的引物後，分析其在F2群體中的分布。通過在F2代分離群體中的分布進行數據分析，根據連鎖交換規律，利用群體基因型資料構建油菜的遺傳圖譜，所用軟體為Joinmap3.0，最小LOD值設為2.5，獲得連鎖圖譜（圖2為第22條連鎖群圖譜）。將F2群體的200個單株的含油量數據及多態性引物的分布情況輸入計算機，運行WinQTLcart4.0軟體對數據進行關聯性分析，單向方差分析測得與含油量性狀相關的機率P值和位點對含油量性狀的貢獻率（表2，圖3）。結果表明，P＜0.01的分子標記即與一個主效基因位點連鎖（表1）。
標記 | 上游引物 | 下游引物 |
BN6A2-1 | CTTTGTGTGGACTTTTAGAACTTTA | CGCAGCTTTTGGCCCACCTG |
Oa55-1 | FGGTTCCAAAGGAAGGAATGCC | CCGACCAAACAGGATACAAC |
主效基因位點 | 標記 | P值 | 貢獻率 |
BnOCN22-1 | BN6A2-1 | 0.000 | 12.39％ |
BnOCN22-2 | Oa55-1 | 0.000 | 8.46％ |
- 實施例5 分子標記Oa55-1在含油量育種中的套用
利用中油036高油品系與另一抗倒伏高產但含油量僅為38％左右的品系雜交後種植F2代，在F2代苗期進行分子鑑定。具體步驟與上述統計多態性引物在F2群體中的分布過程類似，包括F2分離群體葉片總DNA的提取（見實施例2）、聚丙烯醯胺凝膠電泳及分布統計（實施例3和4）等。
結果如圖4中Oa55-1引物所擴增的F2不同單株的條帶所示，6號圓圈中的條帶在高含油量株系中不存在。因此，在F2代中1、2、5、8號油菜苗即可保留下來。種子收穫後的含油量測試結果表明，通過分子標記輔助選擇得到的植株，一半以含油量上超過45％（表3）。在保留下來的植株中再藉助抗倒儀和測千粒重的方法篩選抗倒伏高產的株系。通過檢測與含油量性狀相關的分子標記，即可以預測含油量的高低，在苗期進行淘汰，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率，進而可以快速篩選高含油量株系用於油菜含油量育種。
編號 | 含油量 | 編號 | 含油量 |
X012-47 | 51.5 | X012-60 | 45.73 |
X012-276 | 49.93 | X012-184 | 45.54 |
X012-84 | 48.88 | X012-37 | 44.5 |
X012-194 | 48.88 | X012-85 | 43.92 |
X012-76 | 47.88 | X012-25 | 43 |
X012-233 | 47.61 | X012-137 | 42.63 |
X012-166 | 47.15 | X012-59 | 42.57 |
X012-8 | 47.12 | X012-244 | 41.89 |
X012-161 | 46.81 | X012-229 | 41.43 |
X012-51 | 46.8 | X012-248 | 41.42 |
X012-53 | 46.33 | X012-218 | 41.12 |
X012-63 | 46.3 | X012-62 | 40.72 |
X012-50 | 46.25 | X012-193 | 40.51 |
X012-170 | 46.25 | X012-147 | 40.06 |
X012-220 | 45.88 | X012-158 | 39.94 |
序列表 | |
<110> 中國農業科學院油料作物研究所 | |
<120> 油菜含油量性狀主效基因位點及套用 | |
<130> 油菜含油量性狀主效基因位點及套用 | |
<140>200910063481X | |
<141>2009-08-07 | |
<160>4 | |
<170>PatentIn version 3.1 | |
<210>1 | |
<211>25 | |
<212>DNA | |
<213> 人工合成 | |
<400>1 | |
ctttgtgtgg acttttagaa cttta | 25 |
<210>2 | |
<211>20 | |
<212>DNA | |
<213> 人工合成 | |
<400>2 | |
cgcagctttt ggcccacctg | 20 |
<210>3 | |
<211>21 | |
<212>DNA | |
<213> 人工合成 | |
<400>3 | |
ggttccaaag gaaggaatgc c | 21 |
<210>4 | |
<211>20 | |
<212>DNA | |
<213> 人工合成 | |
<400>4 | |
ccgaccaaac aggatacaac | 20 |
榮譽表彰
2016年12月7日，《油菜含油量性狀主效基因位點及套用》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
