《水泡性口炎病毒G蛋白受體的篩選及鑑定》是依託吉林大學，由宋德光擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：水泡性口炎病毒G蛋白受體的篩選及鑑定
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：宋德光
- 依託單位：吉林大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
水泡性口炎病毒(VSV)是引起人和多種哺乳動物水泡性口炎的重要病原，但其感染的分子機制尚不明確。囊膜糖蛋白（G蛋白）在病毒感染過程中發揮重要作用，G蛋白受體在病毒感染過程中的致病機制也已成為研究的熱點。本項目在體外原代培養新生犢牛口腔黏膜上皮細胞的基礎上，構建含有VSV-G蛋白基因片段的誘餌質粒，採用酵母雙雜交技術篩選上皮細胞膜中與VSV-G相互作用的受體基因；將篩選出的受體基因進行克隆和表達，套用鎳離子親和層析柱純化表達的受體蛋白，將該蛋白與VSV孵育後接種口腔黏膜上皮細胞，檢測該蛋白在VSV感染過程中的功能；採用螢光定量RT-PCR方法檢測受體在體外培養細胞中的表達情況。本課題不僅為研究G蛋白及其受體在水泡性口炎發病機制中的作用奠定基礎，同時有助於揭示病毒的感染途徑和複製過程等一系列科學問題，而且為該病的防治和抗病育種提供重要的靶基因。
結題摘要
水泡性口炎病毒（VSV）是引起人和多種哺乳動物水泡性口炎的重要病原，其感染細胞的分子機制目前還不明確。為研究VSV在細胞膜上的受體，本項目以實驗室前期分離的牛源VSV為研究對象，開展了VSV易感的牛腎細胞（MDBK）受體的篩選和鑑定工作。首先成功構建了用於酵母雙雜交的MDBK細胞cDNA文庫，用於下一步受體的篩選。同時，構建了VSV-G蛋白誘餌表達載體，並對其自激活和毒性進行了檢測，表明構建的誘餌質粒並無自激活和毒性作用，可以用於酵母雙雜交。將文庫菌液與誘餌菌液雜交混合培養，將雜交產物於固體培養基上進行多次培養，篩選出兩種與VSV-G相互作用的蛋白：半乳糖凝集素1（LGALS1）和核糖體蛋白S20（RPS20）。經驗證，篩選得到的兩種獵物質粒均能與誘餌蛋白而非PGBKT7空載體發生相互作用。分別將LGALS1和RPS20的基因片段插入原核表達載體pGEX-4T-1中，構建LGALS1的重組質粒pGEX-4T-L和RPS20的重組質粒pGEX-4T-R，誘導表達LGALS1和RPS20蛋白，並對其進行了純化，western blot檢測結果表明二者成功表達。His pull-down試驗對篩選到的兩種蛋白與VSV-G蛋白間的相互作用進行了驗證，表明GST-R融合蛋白能夠與VSV-G蛋白在體外發生特異性結合，但相互作用較弱，而GST-L融合蛋白與VSV-G蛋白在體外發生特異性結合的相互作用較強；間接免疫螢光證實LGALS1和VSV-G在BHK-21細胞中可發生相互作用；將pN1-LGALS1和pEF1α-VSV-G共轉染至BHK-21細胞中，通過免疫共沉澱試驗進一步驗證了LGALS1和VSV-G在細胞中的相互作用。套用螢光定量RT-PCR方法對VSV感染MDBK細胞前後LGALS1和RPS20的表達情況進行檢測結果表明，感染後LGALS1和RPS20的表達量均有顯著提高，提示這兩種蛋白可能在VSV感染細胞有重要的意義。將VSV與表達的LGALS1蛋白相互作用後再接種細胞，與對照組相比，感染細胞出現CPE明顯減少的特點，表明該蛋白具有干擾VSV對細胞的感染作用。但RPS20蛋白對VSV感染細胞的阻斷效果相對較弱。綜合以上結果分析，LGALS1可能為VSV感染細胞的受體蛋白。本研究為深入開展VSV的感染、複製和一系列的分子致病機制研究奠定了基礎。
